GB 5413.37-2010发布稿 乳跟乳制品中黄曲霉毒素M1的测定 发布稿.rarGB 5413.37-2010发布稿 乳跟乳制品中黄曲霉毒素M1的测定 发布稿.rar

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中华人平易近共跟国国家规范中华人平易近共跟国国家规范 GB 5413.372010 中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实行 食物僻静国家规范 乳跟乳制品中黄曲霉毒素 M1的测定 National food safety standard Determination of aflatoxin M1 in milk and milk products GB 5413.372010 I 前 言 本规范第一法对应于ISO145012007 Milk and milk powder-determination of aflatoxin M1 content -clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-perance liquid chromatography, 本规范第一法与ISO14501 2007的分歧性水平为非等效; 本规范第二法跟第三法交流GB/T 18980-2003; 本规范第四法来自于NY/T 1664-2008牛乳中黄曲霉毒素M1的快速检测 双流向酶联免疫法 。 本标准附录A跟附录B为资料性附录。 GB 5413.372010 1 食物僻静国家规范 乳跟乳制品中黄曲霉毒素 M1的测定 1 规模 本规范规则了乳跟乳制品中黄曲霉毒素 M1的测定方法。 规范第一法适用于乳跟乳制品中黄曲霉毒素 M1的测定;第二法适用于乳、乳粉,以及低脂乳、脱 脂乳、低脂乳粉跟脱脂乳粉中黄曲霉毒素 M1的测定;第三法适用于乳跟乳粉中黄曲霉毒素 M1的测定; 第四法适用于液态乳跟乳粉中黄曲霉毒素 M1的测定。 2 模范性援用文件 本规范中援用的文件关于本规范的应用是必不可少的。 素日注日期的援用文件, 仅所注日期的版本 适用于本规范。素日不注日期的援用文件,其最新版本(包含全部的修正单)适用于本规范。 第一法 免疫亲跟层析污染 液相色谱串联质谱法 3 道理 试样液体或固体试样提取液经均质、超声提取、离心,取上清液经免疫亲跟柱污染,洗脱液经氮气 吹干,定容,微孔滤膜过滤,经液相色谱疏散,电喷雾离子源离子化,多回声离子监测(MRM)措施 检测。基质加标外标法定量。 4 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为 GB/T 6682 规则的一级水。 4.1 甲酸(HCOOH) 。 4.2 乙腈 CH3CN色谱纯。 4.3 煤油醚(CnH2n2) 沸程为30 ℃~60 ℃。 4.4 三氯甲烷(CHCl3) 。 4.5 氮气纯度≥99.9 。 4.6 黄曲霉毒素M1规范样品纯度≥98。 4.7 乙腈-水溶液14在400 mL水中介入100 mL乙腈。 4.8 乙腈-水溶液19在450 mL水中介入50 mL乙腈。 4.9 0.1 甲酸水溶液吸取1 mL 甲酸(4.1) ,用水稀释至1000 mL。 4.10 乙腈-甲醇溶液(5050) 在500 mL乙腈中介入500 mL甲醇。 4.11 氢氧化钠溶液(0.5 mol/L) 称取2 g氢氧化钠消融于100 mL水中。 GB 5413.372010 2 4.12 空白基质溶液 区分称取与待测样品基质相同的、不含所测黄曲霉毒素的阴性试样8份于100 mL烧杯中。以下支配 按6.1试液提取跟6.2 污染措施举行。兼并所得8份试样的纯化液,用0.22 μm 微孔滤膜的一次性滤头 (5.23)过滤。弃去前0.5 mL滤液,接取年夜量滤液供液相色谱-质谱联用仪检测。 掉掉色谱-质谱图后,比照附录 A 中的图 A.2,在响应的保管时间处,应不含黄曲霉毒素 M1。剩 余滤液转移至棕色瓶中,在-20 ℃电冰箱内生涯,供配制规范系列溶液应用。 4.13 黄曲霉毒素M1规范蕴藏溶液区分称取规范品黄曲霉毒素M1 0.10 mg(准确至0.01 mg) ,用三氯 甲烷(4.4)消融定容至10 mL。此规范溶液浓度为0.01 mg/mL。溶液转移至棕色玻璃瓶中后,在-20 ℃ 电冰箱内生涯,备用。 4.14 黄曲霉毒素M1规范系列溶液吸取黄曲霉毒素M1 规范蕴藏溶液(4.13)10 ?L于10 mL容量瓶中, 用氮气将三氯甲烷吹至近干,空白基质溶液(4.12)定容至刻度,所得浓度为10 ng/mL的M1规范中央溶 液。再用空白基质溶液(4.12)将黄曲霉毒素M1规范中央溶液稀释为0.5 ng/mL、0.8 ng/mL、1.0 ng/mL、 2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、6.0 ng/mL、8.0 ng/mL的系列规范变乱液。 5 仪器跟设备 5.1 液相色谱-质谱联用仪,带电喷雾离子源。 5.2 色谱柱ACQUITY UPLC HSS T31,柱长100 mm,柱内径2.1 mm;填料粒径1.8 μm,或整齐性 能的色谱柱。 5.3 天平感量为0.001 g跟0.00001 g。 5.4 匀浆器。 5.5 超声波洗迓洫器。 5.6 离心计心情转速≥6000 转/分钟。 5.7 50 mL具塞PVC离心管。 5.8 水浴温控30 ℃士2 ℃,50 ℃士2 ℃,温度规模25 ℃~60 ℃。 5.9 容量瓶100 mL。 5.10 玻璃烧杯250 mL,50 mL。 5.11 带刻度的磨口玻璃试管5 mL,10 mL,20 mL。 5.12 移液管1.0 mL,2.0 mL跟50.0 mL。 5.13 玻璃棒。 5.14 10目圆孔筛。 5.15 250 mL分液漏斗。 5.16 100 mL圆底烧瓶。 5.17 改动蒸发仪。 1给出这一信息是为了便当本规范的应用者,并不表现对该产物的招认,假如其他等效产物存在相同的结果,则可应用这 些等效的产物。 GB 5413.372010 3 5.18 pH计精度为0.01。 5.19 250 mL具塞锥形瓶。 5.20 免疫亲跟柱针筒式 3 mL。 5.21 10 mL跟50 mL一次性打针器。 5.22 固相萃取装配(带真空系统) 。 5.23 一次性微孔滤头带0.22 μm微孔滤膜(水相系) 。 6 剖析措施 6.1 试液提取 6.1.1 乳称取50 g准确至0.01 g混匀的试样,置于50 mL具塞离心管5.7中,在水浴5.8 中加热 到35℃~37 ℃。在6000 转/分钟下离心15 min。搜集全部上清液,供污染用。 6.1.2 发酵乳包含固体状、 半固体状跟带果肉型 称取50 g准确至0.01 g混匀的试样, 用0.5 mol/L 的 氢氧化钠溶液 (4.11) 在酸度计5.18唆使下调pH至7.4, 在 9500 转/分钟下匀浆5.45 min, 以下按 6.1.1 举行支配。 6.1.3 乳粉跟粉状婴幼儿配方食物称取 10 g准确至0.01 g试样,置于250 mL 烧杯中。将50 mL 已 预热到50 ℃的水介入到乳粉中,用玻璃棒将其混杂平均。假如乳粉仍未完好消融,将烧杯置于50℃的 水浴5.8中安排30 min。消融后冷却至20 ℃,移入100 mL 容量瓶中,用年夜量的水分次洗迓洫烧杯,洗迓洫 液一并移入容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀后区分移至两个50 mL离心管5.7中,在6000转/分钟下 离心15 min,混杂上清液,用移液管移取50mL上清液供污染处置处分用。 6.1.4 干酪称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g准确至0.01 g,置于50 mL离心管5 .7中,加 2 mL水跟30 mL甲醇,在9500 转/分钟下匀浆5 min,超声提取30 min,在6000 转/分钟下离心15 min。 搜集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中介入30 mL煤油醚(4.3) ,振摇2 min,待分层后, 将下层移于50 mL烧杯中,弃去煤油醚层。重复用煤油醚提取2次。将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中, 减压稀释至约2 mL,稀释液倒入离心管中,烧瓶用乙腈-水溶液14(4.7)5 mL分2次洗迓洫,洗迓洫液一 并倒入50 mL离心管中,加水稀释至约50 mL,在6000 转/分钟下离心 5 min,上清液供污染处置处分。 6.1.5 奶油称取5g准确至0.01 g试样,置于50 mL烧杯中,用20 mL煤油醚4.3将其消融并移于 250mL具塞锥形瓶中。 加20 mL水跟30 mL甲醇, 振荡30 min后, 将全部液体移于分液漏斗中, 待分层后, 将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中,在改动蒸发仪(5.17)中减压稀释至约5 mL,加水稀释至约50 mL,供污染处置处分。 6.2 污染 6.2.1 免疫亲跟柱的准备 将一次性的50 mL打针器筒与亲跟柱5.20上顶部相串联,再将亲跟柱与固相萃取装配衔接起来。 注依据免疫亲跟柱的应用仿单央求,控制试液的pH值。 6.2.2 试样的纯化 将以上 6.1 试液提取液移至 50 mL 打针器筒5.21中,调理固相萃取装配的真空系统,控制试样以 2 mL/分钟~3 mL/分钟摇动的流速过柱。取下 50 mL 的打针器筒,装上 10 mL 打针器筒。打针器筒内加 入水,以摇动的流速洗柱,然后,抽干亲跟柱。脱开真空系统,在亲跟柱下部放入 10 mL 刻度试管, 上部装上另一个 10 mL 打针器筒, 介入 4 mL 乙腈4.2,洗脱黄曲霉毒素 M1, 洗脱液搜集在刻度试管中 5.11中,洗脱时间不少于 60 秒。然后用氮气慢慢地在 30 ℃下将洗脱液蒸发至近干 假如蒸发至干, 会丧掉黄曲霉毒素 M1 ,用乙腈-水溶液(19)稀释至 1 mL。 GB 5413.372010 4 6.3 液相色谱参考前提 运动相A 液,0.1 甲酸溶液;B 液,乙腈-甲醇溶液(11) 。 梯度洗脱拜见附录A中的表A.1。 运动相运动速度0.3 mL/min。 柱温35 ℃。 试液温度20 ℃。 进样量10 ?L。 6.4 质谱参考前提 检测措施多离子回声监测(MRM),详见表1中母离子、子离子跟碰撞能量。扫描图拜见附录A 中的图A.1。 表1 离子抉择参数表 黄曲霉毒素 母离子 定量子离子 碰撞能量 定性质离子 碰撞能量 离子化措施 M1 329.0 273.5 22 259.5 22 ESI 离子源控制前提拜见附录A中的表A.2。 6.5 定性 试样中黄曲霉毒素 M1色谱峰的保管时间与响应规范色谱峰的保管时间相比照, 变革规模应在±2.5 %之内。 黄曲霉毒素 M1的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应年夜于就是 3(S/N≥3) , 定量离子的重构离 子色谱峰的信噪比应年夜于就是 10(S/N≥10) 。 每种化合物的质谱定性离子必需出现,至少应包含一个母离子跟两个子离子,而且统一检测批次, 对统一化合物, 样埔恍目的化合物的两个子离子的相对品貌比与浓度相当的规范溶液比拟, 其允许缺陷 不逾越跨过表 2 规则的规模。 表 2 定性时相对离子品貌的最年夜允许缺陷 相对离子品貌 >50% >20%至 50% >10%至 20% ≤10% 允许相对缺陷 ±20 ±25 ±30 ±50 各检测目的化合物以保管时间跟两对离子(特征离子对/定量离子对)所对应的 LC-MS/MS 色谱峰面积相对品貌举行定性。央求被测试样中目的化合物的保管时间与规范溶液中目的化合 物的保管时间分歧(分歧的前提是缺陷小于 20) ,同时央求被测试样中目的化合物的两对离子 对应 LC-MS/MS 色谱峰面积比与规范溶液中目的化合物的面积比分歧。 6.6 试样测定 依据 6.3 跟 6.4 树立的前提,测定试液(6.2)跟规范系列溶液(4.14)中黄曲霉毒素 M1的离子 强度,外标法定量。色谱图见附录 A 的图 A.2。 色谱参考保管时间黄曲霉毒素 M1 3.23 min。 6.7 空白试验 不称取试样,按6.5的措施做空白实行。应确认不含有干扰被测组分的物资。 6.8 规范曲线绘制 GB 5413.372010 5 将规范系列溶液(4.14)由低到高浓度进样检测,以峰面积-浓度作图,掉掉规范曲线回归方程。 6.9 定量测定 待测样液中被测组分的响应值应在规范曲线线性规模内, 逾越跨过线性规模时, 则应将样液用空白基质 溶液稀释后从新进样剖析或淘汰取样量,从新按6.1举行处置处分后再进样剖析。 7 剖析结果的表述 外标法定量,按式(1)算计黄曲霉毒素M1的残留量。 m fVA X 1 (1) 式中 X试样中黄曲霉毒素 M1的含量,单元为微克每千克(?g/kg) ; A试样中黄曲霉毒素 M1的浓度,单元为纳克每毫升(ng/mL) ; V样品定容体积,单元毫升(mL); f样液稀释因子; m试样的称样量,单元克(g) 。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管三位有用数字。 8 精致度 在重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的相对差值不得逾越跨过算术平均值的 10 。 第二法 免疫亲跟层析污染高效液相色谱法 9 道理 亲跟柱内含有的黄曲霉毒素 M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上,当试样经过亲跟柱时,抗 体抉择性的与黄曲霉毒素 M1抗原键合,组成抗体抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质,然后用洗 脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素 M1,搜集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液 中黄曲霉毒素 M1含量。 10 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为 GB/T 6682 规则的一级水。 10.1 免疫亲跟柱亲跟柱的最年夜容量不小于100 ng黄曲霉毒素M1相当于50 mL浓度为2 ?g/L的试样, 当规范溶液含有4 ng黄曲霉毒素M1相当于50 mL浓度为80 ng/L的试样时采用率不低于80 。 应当活期 搜索亲跟柱的柱效跟采用率,关于每个批次的亲跟柱至少搜索一次见10.1.1跟10.1.2。 10.1.1 柱效搜索 用移液管11.4移取 1.0 mL 的黄曲霉毒素 M1规范蕴藏液10.5.2到 20 mL 的锥形试管中11.9。 用恒流的氮气10.3将液体冉冉吹干,然后用 10 mL l0 的乙腈水溶液10.2.2消融残渣,使劲摇曳。 将该溶液介入到 40 mL 的水中,充分混匀,全部经过免疫亲跟柱(10.1) 。按仿单央求应用免疫 亲跟柱。淋洗免疫亲跟柱后,洗脱黄曲霉毒素 M1。将洗脱液举行妥当稀释后,用高效液相色谱仪测定 免疫亲跟柱键合的黄曲霉毒素 M1含量。 算计黄曲霉毒素 M1的采用率,将其结果与 10.1 中所央求的目的举行比照。 GB 5413.372010 6 10.1.2 采用率搜索 用移液管11.4移取 0.8 mL 0.005 ?g/mL 的黄曲霉毒素 M1规范变乱液10.5.3到 10 mL 的水中, 充分混匀,全部经过免疫亲跟柱。按仿单应用免疫亲跟柱。淋洗免疫亲跟柱,洗脱下黄曲霉毒素 M1。 将洗脱液举行妥当稀释后,用高效液相色谱仪测定免疫亲跟柱键合的黄曲霉毒素 M1含量。算计黄曲霉 毒素 M1的采用率,将其结果与 10.1 中所央求的目的举行比照。 10.2 乙腈CH3CN色谱纯。 10.2.1 25 乙腈水溶液将250 mL的乙腈10.2与750 mL的水混溶应用前需求脱气。 10.2.2 10 乙腈水溶液将100 mL的乙腈10.2与900 mL的水混溶应用前需求脱气。 10.3 氮气(N2) 。 10.4 三氯甲烷介入0.5 ~1.0 质量比与三氯甲烷质量比的乙醇举行摇动。 10.5 黄曲霉毒素M1规范溶液,纯度≥98。 10.5.1 浓度的校订 黄曲霉毒素 M1三氯甲烷规范溶液浓度为 10 ?g/mL。依据下面的方法,在最年夜吸取波段处测定溶液 的吸光度,以确定黄曲霉毒素 M1的实践浓度。 用分光光度计(11.11)在 340 nm~370 nm 处测定,扣除三氯甲烷的空白本底,读取规范溶液的吸 光度值。在接近 360 nm 最年夜吸取波段 λmax处,测得吸光度值为 A,依据式(2)算计浓度值 ε 100 MA ci2 式中 ci黄曲霉毒素 M1实践浓度,单元为微克每毫升 ?g/mL; A在λmax处测得的吸光度值; M328 g/mol,黄曲霉毒素 M1摩尔质量,单元为克每摩尔(g/mol) ; ε19950,溶于三氯甲烷中的黄曲霉毒素 M1的吸光系数,单元为平方米每摩尔(m2/mol) 。 10.5.2 规范蕴藏液 确定黄曲霉毒素 M1规范溶液的实践浓度值后(10.5.1) ,连续用三氯甲烷将其稀释为浓度为 0.1 ?g/mL 的蕴藏液。蕴藏液密封后于冰箱中 5 ℃以下避光生涯。在此前提下,蕴藏液可以摇动两个月。 10.5.3 黄曲霉毒素M1规范变乱液 从冰箱中掏出规范蕴藏液(10.5.2)安排至室温,移取必定量的蕴藏液举行稀释制备成变乱液。工 作液临用前配制。 黄曲霉毒素 M1规范变乱液配制用移液管(11.4)准确移取 1.0 mL 的蕴藏液(10.5.2)到 20 mL 的锥形试管中(11.9) ,用温跟的氮气(10.3)将溶液吹干,然后用 20.0 mL10 的乙腈水溶液(10.2.2) 将残渣从新消融,30 min 内振摇,混匀,配成浓度为 0.005 ?g/mL 的黄曲霉毒素 M1规范变乱液。在用 氮气对蕴藏液吹干的过程中,必定要细致支配,抑止因温度高涨太多而出现结露。 在作规范曲线时,黄曲霉毒素 M1的进样相对含量区分是 0.05 ng、0.1 ng、0.2 ng、0.4 ng。依据高 效液相色谱仪进样环的容积量,用变乱液设备一系列妥当浓度的黄曲霉毒素 M1规范溶液,稀释液用 10 乙腈水溶液(10.2.2) 。 11 仪器跟设备 11.1 一次性打针器10 mL跟50 mL。 11.2 真空系统。 GB 5413.372010 7 11.3 离心计心情转速≥7000 转/分钟。 11.4 移液管1.0 mL、2.0 mL跟50.0 mL。 11.5 玻璃烧杯250 mL。 11.6 容量瓶100 mL。 11.7 水浴温控30 ℃± 2℃,50 ℃±2 ℃,温度规模36℃±1 ℃。 11.8 滤纸中速定性滤纸。 11.9 带刻度的磨口锥形玻璃试管5 mL、10 mL、20 mL。 11.10 高效液相色谱仪 11.10.1 无脉冲泵妥当恒定体积流量约1 mL/min的泵。 11.10.2 进样系统存在硬朗或可变容积的进样环,进样体积50 ?L~500 ?L。 11.10.3 反相色谱柱填充3 μm大约5 μm的十八烷基硅胶,加有填充反相原料的保护柱。 11.10.4 荧光检测器存在365 nm激起波长、435 nm发射波长,在妥当的色谱前提下可以测定0.02 ng 的黄曲霉毒素M1相当于5倍噪音。 11.11 紫外分光光度计波长规模为200 nm~400 nm。 11.12 天平感量为0.01 g。 12 剖析措施 全部的支配剖析均应在避光前提下举行。 12.1 试样制备 12.1.1 乳将试样在水浴(11.7)中加热到35℃~37℃。用滤纸(11.8)过滤(依据状况,可以需求多 层滤纸举行过滤) ,大约在7000 转/分钟离心15 min。至少搜集50 mL试样,依据12.4连续支配。 12.1.2 乳粉称取10 g样品(准确到0.1 g) ,置于250 mL的烧杯(11.5)中。将50 mL已预热到50℃的 水屡次年夜量地介入到乳粉中,用搅拌棒将其混杂平均。假如乳粉不能完好消融,将烧杯在50℃的水浴 (11.7)中安排至少30 min,细致混匀。将消融的乳粉冷却至20℃后,移入100 mL容量瓶(11.6)中,用 年夜量的水分次淋洗烧杯,淋洗液一并移入容量瓶中,再用水定容至刻度。用滤纸(11.8)过滤乳,大约 在7000转/分钟下离心15 min。至少搜集50 mL的乳试样,依据12.4连续举行剖析。 12.1.3 发酵乳依据“第一法”中6.1.2的前处置处分方法举行。 12.1.4 干酪依据“第一法”中6.1.4的前处置处分方法举行。 12.1.5 奶油依据“第一法”中6.1.5的前处置处分方法举行。 12.2 免疫亲跟柱的准备 将一次性的 50 mL 打针器筒(11.1)与亲跟柱(10.1)的顶部相连,再将亲跟柱与真空系统(11.2) 衔接起来。 12.3 试样的提取与纯化 用移液管移取 50 mL 试样(12.2.1 或 12.2.2)到 50 mL 打针器(11.1)中,调理真空系统(11.2) , 控制试样以 2 mL/min~3 mL/min 摇动的流速过柱。 取下 50 mL 的打针器,装上 10 mL 打针器。打针器内介入 10 mL 水,以摇动的流速洗柱,然后, GB 5413.372010 8 抽干亲跟柱。 脱开真空系统,装上另一个 10 mL 打针器,介入 4 mL 乙腈10.2。慢慢推进打针器栓塞,经过柱 塞控制流速,洗脱黄曲霉毒素 M1,洗脱液搜集在锥形管11.9中,洗脱时间不少于 60 s。然后用温跟 的氮气10.3在 30 ℃下将洗脱液蒸发至体积为 50 ?L~500 ?L假如蒸发至干, 会丧掉黄曲霉毒素 M1。 再用水稀释 10 倍至最终体积为 Vf即 500 ?L~5000 ?L。 注假如注入高效液相色谱仪含黄曲霉毒素 M1的样品,乙腈含量逾越跨过 10%,色谱峰变宽。假如水含量逾越跨过 90 %, 则对色谱峰的外形没有影响。 12.4 高效液相色谱剖析 12.4.1 色谱前提 色谱柱C18,长25 cm,内径4.6 mm; 运动相25 乙腈水溶液10.2.1; 流速1 mL/min。 12.4.2 黄曲霉毒素M1的规范曲线 依据高效液相色谱仪进样环容积,抉择妥当进样体积数 Vi,区分注入含有 0.05 ng、0.1 ng、0.2 ng 跟 0.4 ng 的黄曲霉毒素 M1规范溶液。绘制成峰面积或峰高对黄曲霉毒素 M1质量的规范曲线。 12.4.3 色谱剖析 依据样品洗脱液色谱图中黄曲霉毒素 M1的峰高或峰面积值,从规范曲线上得出样品洗脱液中所含 有的黄曲霉毒素 M1质量数ng。 假如样品洗脱液的黄曲霉毒素 M1的峰面积或峰高值高于规范曲线规模,用水定容稀释样品洗脱液 后,从新进样剖析。 13 剖析结果的表述 13.1 乳 应用式3算计被测样品中的黄曲霉毒素 M1的含量 ωm。 VV Vm i fA m 1 ω(3) 式中 ωm黄曲霉毒素 M1的含量,单元为微克每升 ?g/L; mA样品洗脱液黄曲霉毒素 M1的峰面积或峰高从规范曲线上得出的黄曲霉毒素 M1的质量,单 位为纳克ng; Vi样品洗脱液的进样体积,单元为微升?L; Vf样品洗脱液的最终体积,单元为微升?L; V经过免疫亲跟柱被测样品的体积,单元为毫升mL。 式3适用于未经稀释的试样,否则应当乘以稀释倍数。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管三位有用数字。 13.2 乳粉 应用式4算计被测样品中的黄曲霉毒素 M1的含量 ωp。 mV Vm i fA p 1 ω 4 GB 5413.372010 9 式中 ωp黄曲霉毒素 M1的含量,单元为微克每千克?g/kg; m50mL 样液12.4中所含乳粉质量,单元为克g。 mA、Vf、Vi的寄义与 14.1 中所界说的一样。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管三位有用数字。 14 精致度 各实行室试验结果的精致度总结于附录 B 中,这些数据不适用于其他的污染水温跟被测样。 第三法 免疫层析污染荧光分光度法 15 道理 试样经过离心、脱脂、过滤,滤液经含有黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体的免疫亲跟柱层析污染, 黄曲霉毒素M1交联在层析介质中的抗体上。 此抗体对黄曲霉毒素M1存在埋头性, 当样品经过亲跟柱时, 抗体抉择性的与全部存在的黄曲霉毒素M1抗原键合。用甲醇-水19将免疫亲跟柱上杂质除去,以 甲醇-水82经过免疫亲跟柱洗脱,将溴溶液衍生后的洗脱液置于荧光光度计中测定黄曲霉毒素M1含 量。 16 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为 GB/T 6682 规则的一级水。 16.1 甲醇CH3OH色谱纯。 16.2 氯化钠NaCl。 16.3 甲醇-水19取10 mL甲醇介入90 mL水。 16.4 甲醇-水82取80 mL甲醇介入20 mL水。 16.5 溴溶液蕴藏液0.01 称取适量溴,溶于水后,配成0.01的蕴藏液,避光生涯。 16.6 溴溶液变乱液0.002 取10 mL0.01 的溴溶液蕴藏液介入40 mL水混匀,于棕色瓶中生涯备 用。现用现配。 16.7 二水硫酸奎宁[C20H24N2O22·H2SO4·2H2O]。 16.8 硫酸溶液0.05 mol/L取2.8 mL浓硫酸,愚钝介入适量水中,冷却后定容至1000 mL。 16.9 荧光光度计校准溶液称取0.340 g 二水硫酸奎宁, 用0.05 mol/L硫酸溶液 (16.8) 消融并定容至100 mL,此溶液荧光光度计读数相当于2.0 ?g/L黄曲霉毒素M1规范溶液。0.05 mol/L硫酸溶液(16.8)荧光 光度计读数相当于0.0 ?g/L黄曲霉毒素M1。 17 仪器跟设备 17.1 荧光光度计。 17.2 离心计心情 转速≥7000 转/分钟。 17.3 玻璃纤维滤纸直径 11 cm,孔径1.5 μm。 GB 5413.372010 10 17.4 黄曲霉毒素M1免疫亲跟柱。 17.5 气氛压力泵。 17.6 玻璃试管直径12 mm,长75 mm,无荧光特征。 17.7 玻璃打针器10 mL。 18 剖析措施 18.1 试样提取 18.1.1 乳取 50.0 mL试样,介入1.0 g氯化钠(16.2),7000转/分钟下离心10 min,警醒移取用于分 析的乳底脱脂层,不要碰触顶部肪层,将脱脂的乳以玻璃纤维滤纸(17.3)过滤,滤液备用。 18.1.2 乳粉称取 5 g 试样准确至0.01 g,用30 ℃~60 ℃水将其冉冉消融,定容至50 mL,介入1.0 g 氯化钠(16.2),以下按18.2的措施支配。 18.2 污染 将免疫亲跟柱(17.4)衔接于10 mL玻璃打针器(17.7)下。准确移取10.0 mL上述滤液(18.1)注 入玻璃打针器中,将气氛压力泵(17.5)与打针器衔接,调理压力使溶液以约6 mL/min流速愚钝经过免 疫亲跟柱(17.4),直至2 mL~3 mL气氛经过柱体。以10 mL甲醇-水19(16.3)洗迓洫柱子两次,弃 去全部流出液,并使2 mL~3 mL气氛经过柱体。准确介入1.0 mLV1甲醇-水8十2(16.4)洗脱液洗 脱,流速为1 mL/min~2 mL/min,搜集全部甲醇-水洗脱液于玻璃试管(17.6)中,备用。 18.3 测定 18.3.1 荧光光度计校准 在激起波长360 nm,发射波长450 nm前提下,以0.05 mol/L的硫酸溶液(16.8)为空白,调理荧光 光度计的读数值为 0.0 μg/L; 以荧光光度计校准溶液(16.9)调理荧光光度计的读数值2.0 μg/L。 18.3.2 样液测定 取上述洗脱液介入1.0 mL V 0.002 溴溶液,1 min后立刻于荧光光度计测定样液中黄曲霉毒素 M1含量c1。 18.3.3 空白试验 用水交流试样,按18.1~18.3 措施做空白试验。 19 剖析结果的表述 19.1 乳 乳检测结果按式5算计 V VCC X 10 101 1 ? 5 式中 X1试样中黄曲霉毒素M1含量,单元为微克每升?g/L; C1荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素M1的浓度,单元为微克每升?g/L; C0荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉毒素M1的浓度,单元为微克每升?g/L; GB 5413.372010 11 V1最终污染甲醇-水(82)洗脱液体积,单元为毫升mL; V经过亲跟柱试样体积,单元为毫升mL; 10仪器的读数系数。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管到小数点后一位。 19.2 乳粉 乳粉检测结果按式6算计 m VVCC X ? 10 102 2 6 式中 X2 试样中黄曲霉毒素M1含量,单元为微克每千克?g/kg; C2 荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素M1的浓度,单元为微克每升(?g/L; C0 荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉毒素M1的浓度,单元为微克每升(?g/L; Vl 最终污染甲醇-水82洗脱液体积,单元为毫升mL; V经过亲跟柱试样体积,单元为毫升mL; m50 mL试样中所含乳粉的质量,单元为克每毫升g/mL; 10仪器的读数系数。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管到小数点后一位。 第四法 双流向酶联免疫法 20 道理 应用酶联免疫竞争道理,样品中残留的黄曲霉毒素M1与定量特异性酶标抗体回声,过剩的游离酶 标抗体则与酶标板内的包被抗原团结,经过运动洗迓洫,介入酶显色底物显色后,与规范点比照定性。 21 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为 GB/T 6682 规则的二级水。 21.1 黄曲霉毒素M1双流向酶联免疫试剂盒,2 ℃~7 ℃生涯。 21.1.1 黄曲霉毒素M1系列规范溶液。 21.1.2 酶联免疫试剂颗粒(含特异性酶标抗体) 。 21.1.2.1 抗黄曲霉毒素M1抗体。 劝诫不应损坏,否则立刻销毁。 21.1.2.2 酶团结物。 21.1.3 酶显色底物。 22 仪器跟设备 22.1 样品试管,带有密封盖,内置酶联免疫试剂颗粒(21.1.2) 。 GB 5413.372010 12 22.2 移液器(管) ,450 ?L±50 ?L。 22.3 酶联免疫检测加热器,40℃±5℃。 22.4 双流向酶联免疫检测读数仪。 23 剖析措施 23.1 加热器(22.3)预热到45 ℃±5 ℃,并至少坚持15 min。 23.2 液体试样或乳粉试样复兴复兴后振摇混匀,移取450 ?L至样品试管(22.1)中,充分振摇,使其中的 酶联免疫试剂颗粒(21.1.2)完好消融。 23.3 将样品试管(21.1)跟酶联免疫检测试剂盒(21.1)同时置于预热过的加热器内保温,保温时间5 min~6 min。使试样中的黄曲霉毒素M1跟酶联免疫试剂颗粒中的酶标志黄曲霉毒素M1抗体团结。 23.4 将样品试管内的全部内容物倒入试剂盒(21.1)的样品池中,样品将流经“结果表现窗口”向绿 色的激活环流去。 23.5 当激活环的绿色末尾流掉变为白色时,立刻使劲按下激活环按键。 23.6 试剂盒(21.1)连续安排在加热器(22.3)中保温坚持4 min,使显色回声实现。 23.7 将试剂盒从加热器中掏出水平安排,立刻举行检测结果判读,结果判读应在1 min内实现。 24 剖析结果的表述 24.1 目测判读结果 试样点的颜色深于质控点,或两者颜色相当,检测结果为阴性。 试样点的颜色浅于质控点,检测结果为阳性。 24.2 双流向酶联免疫检测读数仪判读结果 数值≤1.05,表现Negative,检测结果为阴性。 数值>1.05,表现Positive,检测结果为阳性。 注阳性样品需用第一法定量检测方法进一步确认。 25 其他 本规范第一法的定量限为 0.01 μg/kg以乳计;第二法乳粉中黄曲霉毒素 M1的最低检测限为 0.08 μg/kg,乳中黄曲霉毒素 M1的最低检测限为 0.008 μg/L;第三法乳中的黄曲霉毒素 M1的检出限为 0.1 μg/L,乳粉中黄曲霉毒素 M1的检出限为 0.l μg/kg;第四法的检出限为 0.5 μg/kg。 GB 5413.372010 13 附录A (资料性附录) 黄曲霉毒素 M1免疫亲跟层析污染 液相色谱串联质谱法色谱图几慰记疤 A.1 黄曲霉毒素 M1免疫亲跟层析污染 液相色谱串联质谱法色谱图几慰记疤 免疫亲跟层析污染 液相色谱串联质谱法黄曲霉毒素 M1离子扫描图见图 A.1。 免疫亲跟层析污染 液相色谱串联质谱法黄曲霉毒素 M1色谱质谱图见图 A.2。 免疫亲跟层析污染 液相色谱串联质谱法液相色谱梯度洗脱前提见表 A.1。 免疫亲跟层析污染 液相色谱串联质谱法离子源控制前提见表 A.2。 图 A.1 黄曲霉毒素 M1子离子扫描图 图 A.2 黄曲霉毒素 M1色谱质谱图 GB 5413.372010 14 表 A.1 液相色谱梯度洗脱前提 时间(min) 运动相 A 运动相 B 梯度变革曲线 0 68.0 32.0 - 4.2 0 55.0 45.0 6 5.0 0 0.0 100.0 6 5.7 0 0.0 100.0 1 6.0 0 68.0 32.0 6 注1为即时变革,6为线性变革。 表 A.2 离子源控制前提 电离措施 电喷雾电离,负离子 毛细管电压(kV) 3.5 锥孔电压(V) 45 射频透镜1电压(V) 12.5 射频透镜2电压(V) 12.5 离子源温度(℃) 120 锥孔反吹气流量(L/h) 50 脱溶剂气温度(℃) 350 脱溶剂气流量(L/h) 500 电子倍增电压(V) 650 GB 5413.372010 15 附 录 B 资料性附录 多个差异实行室的试验结果 世界各地 16 个实行室介入了低脂肪1%跟高脂肪28 %乳粉样品的协同试验。 高脂肪样品是用于 制作参比物资的剩留物,所以黄曲霉毒素 M1的含量是已知的。 关于乳粉,其污染水平为 0.08 ?g/kg~0.6 ?g/kg,即关于乳而言,污染水平为 8 ng / L~60 ng /L。 试验结果依据 ISO 5725-l 跟 ISO 5725-2 规则的统计方法掉掉,其精致度的数据列于表 B.1。 表 B.1 精致度数据 样品编号 1 2 3 4 5 实行室个数 a 12 4 13 11 14 平均值/ng/kg 81 150 80 202 580 重复性值 r/ng/kg 23 60.1 15 27 203 再现性值 R/ng/kg 52 98 41 61 310 重复性变异系数/ 9.9 14.0 6.8 4.7 12.5 复验性变异系数/ 23 22.7 18.3 10.8 19.1 a 淘汰的实行室数是依据 Cochran 跟 Grubbs 统计方法应当从样本中剔除的数据 图 B.1 高效液相色谱疏散黄曲霉毒素M1的规范图
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