GB 5413.19-2010发布稿 婴幼儿食物跟乳品中游离生物素的测定 发布稿.rarGB 5413.19-2010发布稿 婴幼儿食物跟乳品中游离生物素的测定 发布稿.rar

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中华人平易近共中华人平易近共跟国国家标准跟国国家规范 GB 5413.192010 中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实行 食物僻静国家规范 婴幼儿食物跟乳品中游离生物素的测定 National food safety standard Determination of free biotin in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.192010 I 前 言 本规范交流GB/T 5413.19-1997婴幼儿配方食物跟乳粉 游离生物素的测定。 本标准附录A为模范性附录。 本规范所交流规范的历次版本发布状况为 GB 5413-1985、GB/T 5413.19-1997。 GB 5413.192010 1 食物僻静国家规范 婴幼儿食物跟乳品中游离生物素的测定 1 规模 本规范规则了婴幼儿食物跟乳品中游离生物素的测定方法。 本规范适用于婴幼儿食物跟乳品中游离生物素的测定。 2 模范性援用文件 本规范中援用的文件关于本规范的应用是必不可少的。 素日注日期的援用文件, 仅所注日期的版本 适用于本规范。素日不注日期的援用文件,其最新版本(包含全部的修正单)适用于本规范。 3 道理 应用动物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)对游离生物素的特异性跟敏锐性,定量测定出试样中待 测物资的含量。 在含有除待测物资以外全部营养要素的造就基中, 微生物的开展与待测物资含量呈线性 干系,依据透光率与规范变乱曲线举行比照,即可算计出试样中待测物资的含量。 4 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为 GB/T 6682 规则的二级水。 4.1 菌株动物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),ATCC 8014。 4.2 生物素(d-Biotin 或 Vitamin H)规范品(C10H16N2O3S)纯度≥99 。 4.3 造就基 4.3.1 乳酸杆菌琼脂造就基见附录 A。 4.3.2 乳酸杆菌肉汤造就基见附录 A。 4.3.3 生物素测定用造就基见附录 A。 注一些商品化分化造就基结果优秀,商品化分化造就基按标签说明举行配制。 4.4 乙醇溶液(50 )。 4.5 硫酸溶液(3 )量取 3mL 硫酸介入到水中,定容至 100 mL。 4.6 氢氧化钠溶液(0.5 mol/L)称取 20 g 氢氧化钠溶于 1000 mL 水中。 4.7 氯化钠溶液(9 g/L)称取 9.0 g 氯化钠消融于 1000 mL 水中,分装试管,每管 10 mL。121℃灭 菌 15 min。 4.8 规范溶液的制备 4.8.1 生物素规范蕴藏液(100 μg/mL)称取生物素规范品(4.2)用乙醇溶液(4.4)定容至生物素 浓度为 100 μg/mL,贮于冰箱中。 4.8.2 生物素规范中央液(1 μg/mL)吸取 1 mL 生物素规范蕴藏液(4.8.1),用乙醇溶液(4.4)定 容至 100 mL。 4.8.3 生物素规范变乱液(10 ng/mL)吸取 1 mL 生物素规范中央液(4.8.2),用乙醇溶液(4.4) 定容至 100 mL。 4.8.4 规范曲线变乱液 GB 5413.192010 2 分两个浓度, 高浓度溶液的浓度为 0.2 ng/mL; 低浓度溶液的浓度为 0. 1 ng/mL。 从变乱液中 (4.8.3) 吸取两次各 5 mL,用水区分定容到 250 mL 跟 500 mL。 注全部规范溶液要贮存于冰箱内。4.8.1、4.8.2、跟 4.8.3 生涯期三个月,4.8.4 临用前配制。 5 仪器跟设备 除微生物实行室常规灭菌及造就设备外,其他设备跟原料如下 5.1 天平感量为 0.1 mg。 5.2 pH 计精度≤0.02。 5.3 分光光度计。 5.4 涡旋混杂器。 5.5 离心计心情转速≥2000 转/分钟。 5.6 恒温造就箱36 ℃ ±1 ℃。 5.7 冰箱2 ℃~5 ℃。 5.8 无菌吸管10 mL 具 0.1 mL 刻度 或微量移液器或吸头。 5.9 瓶口分液器0 mL~10 mL。 5.10 锥形瓶200 mL。 5.11 容量瓶(A 类)100 mL,250 mL,500 mL。 5.12 单刻度移液管(A 类)容量 5 mL。 5.13 漏斗直径 90 mm。 5.14 定量滤纸直径 90 mm。 5.15 试管18mm180 mm。 注玻璃仪器应用前,用活性剂(月桂磺酸钠或家用洗迓洫剂介入到洗迓洫用水中即可)对硬玻璃测定管及其他需求的 玻璃器皿举行洗迓洫,洗迓洫之后在 200 ℃干热 2 h。 6 剖析措施 6.1 接种菌悬液的制备 6.1.1 将冻干菌株(4.1)活化后,转接到乳酸杆菌琼脂造就基(4.3.1)中,36 ℃ ±1 ℃造就留宿。再 转接 2~3 代来增强生气盼望。然后再将其从固体造就上转接到乳酸杆菌肉汤造就基(4.3.2)中造就。 6.1.2 将乳酸杆菌肉汤中的造就液以 2000 转/分钟离心 2 min~3 min,倾出上清液,介入 10 mL 氯化 钠溶液(4.7),混匀,再离心 2 min~3 min,如此洗迓洫 3 次~4 次,吸适量该菌悬液于 10 mL 盐水(4.7) 中,待测。 6.1.3 用分光光度计以氯化钠溶液(4.7)做空白,于 550 nm 波长下测菌悬液(6.1.2)的透光率,使 其透光率在 60 ~80 之间。 6.2 样品的处置处分 6.2.1 干粉样品 称取必定量样品(准确至 0.0001 g)于 250 mL 三角瓶中,该样品应含 0.2 μg~0.5 μg 生物素。连续 6.2.3 措施。 6.2.2 液体样品 吸必定量的液体样品于 250 mL 三角瓶中,该样品应含 0.2 μg~0.5 μg 生物素。连续 6.2.3 措施。 6.2.3 样品的提取 GB 5413.192010 3 介入硫酸溶液 (4.5) 100 mL, 121 ℃水解 30 min, 冷却后用氢氧化钠溶液 (4.6) 调理 pH 至 4.5±0.2, 定量转到 250 mL 容量瓶中,用水定容,充分混杂。用滤纸过滤,弃去末了的几毫升。吸取滤液 5 mL, 介入约 20 mL 水,用氢氧化钠溶液(4.6)调 pH 为 6.8±0.2,定量转到 100 mL 容量瓶中,用水定容。 6.3 规范曲线的制作 按表 1 次序递次介入水、规范曲线变乱液(4.8.4)跟生物素测定用造就基(4.3.3)于造就管中,一式三 份。 表1 规范曲线的制作 试管号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 水(mL) 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 规范曲线变乱液 0.1 ng/mL(mL) 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 规范曲线变乱液 0.2 ng/mL(mL) 0 0 0 0 0 0 0 3 4 5 造就基(mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6.4 待测液的制作 按表 2 次序递次加水、样品溶液(6.2.3)跟生物素测定用造就基(4.3.3)于造就管内,一式三份。 每份样品需带样品空白试管一只,管内区分介入5 mL待测液跟5 mL造就基。 表2 待测液的制作 试管号 1 2 3 4 样品空白 水(mL) 4 3 2 1 0 样品溶液(mL) 1 2 3 4 5 造就基(mL) 5 5 5 5 5 6.5 灭菌 将6.3跟6.4中全部的试管盖上试管帽,放入灭菌釜内,121 ℃灭菌5 min(商品造就基按标签说明进 行灭菌)。 6.6 接种 从灭菌釜内掏出试管,将试管矫捷冷却至30 ℃以下。将接种菌悬液(6.1.2)用滴管或移液器向上 述试管中各滴加一滴(约50 ?L),其中规范曲线管中未接种空白S1跟样品空白除外。 6.7 造就 将试管放入造就箱内,36 ℃ ±1 ℃造就19 h~20 h。 6.8 测定 对每支试管举行视觉搜索,接种空白试管 S1 内造就液应是廓清的,假如出现混浊,则结果有用。 6.8.1 以接种空白试管 S1 做比照,测定最高浓度规范曲线试管的吸光度,两小时后从新测定。两次 结果透光率差值若小于 2 ,则掏出全部检验管测其吸光度 A。 6.8.2 以接种空白试管 S2 为空白,调理吸光度为 0,依次读出其他每支试管的吸光度 A,样品空白的 吸光度 A 一并读出。 6.8.3 用涡旋混杂器充分混杂每一支试管(也可以加一滴消泡剂)后,立刻将造就液移入比色皿内进 行测定,波长为 550 nm,待读数摇动 30 s 后,读出吸光度 A,每支试管摇动时间要相同。以生物素标 准品的含量为横坐标,吸光度 A 为纵坐标作规范曲线。 6.8.4 待测液造就试管中,样品空白试管吸光度应小于 0.05。若样品空白试管吸光度年夜于 0.02,介入 待测液 1 mL 的试管的吸光堵夷减去其样品空白试管吸光度值的 1/5, 介入待测液 2 mL 的试管的吸光 GB 5413.192010 4 堵夷减去其样品空白试管吸光度值的 2/5,以词攀类推,作为算计结果的依据。依据待测液的吸光度 A, 从规范曲线中查得该待测液中生物素的浓度, 再依据稀释因子跟称样量算计出试样中生物素的含量。 吸 光度值逾越跨过规范曲线管 S3~S10 规模的试样管要舍去。 6.8.5 对每个编号的待测液试管,用每支试管的吸光度值算计每毫升该编号待测液生物素的含量,并 算计该编号待测液的生物素含量平均值,每支试管测得的该浓度不得逾越跨过该平均值的±15,逾越跨过者要 舍去。假如契合该央求的管数少于全部四个编号待测液总管数的 2/3,需求从新检验。假如契合该央求 的管数年夜于就是本来管数的 2/3, 从新算计每一编号的有用试样管中每毫升测定液生物素含量的平均值, 以此平均值算计全部编号试样管的总平均值 Cx,用于算计试样中的生物素含量。 7 剖析结果的表述 试样中生物素的含量按公式 1 算计 100 1000 f m C X x 1 式中 X试样中生物素的含量,单元为微克每百克(μg/100 g) ; Cx6.8.5 中算计所得的总平均值,单元为纳克(ng) ; m试样的质量,单元为克(g) ; f稀释倍数。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管两位有用数字。 8 精致度 在重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的相对差值不得逾越跨过算术平均值的 10 。 9 其他 本规范检出限为 20.0 μg/kg。 GB 5413.192010 5 附录 A (模范性附录) 造就基跟试剂 A.1 乳酸杆菌琼脂造就基 A.1.1 要素 胨化乳 15.0 g,酵母浸膏 5.0 g,葡萄糖 10.0 g,番茄汁 100 mL,磷酸二氢钾 2.0 g,聚山梨糖单油 酸酯 1.0 g,加水至 1000 mL,调理 pH 至 6.8±0.2(25 ±5℃ ℃) 。 A.1.2 制法 在 A.1.1 中介入 10.0 g 琼脂,加热煮沸,使琼脂熔解。混杂平均后分装试管,每管 10 mL。121 ℃ 高压灭菌 15 min,备用。 A.2 乳酸杆菌肉汤造就基 A.2.1 要素 胨化乳 15.0 g,酵母浸膏 5.0 g,葡萄糖 10.0 g,番茄汁 100 mL,磷酸二氢钾 2.0 g,聚山梨糖单油 酸酯 1.0 g,加水至 1000 mL,调理 pH 至 6.8 ±0.2(25 ℃ ±5 ℃) 。 A.2.2 制法 将 A.2.1 要素加热煮沸,混杂平均后分装试管,每管 10 mL。121 ℃高压灭菌 15 min。 A.3 生物素测定用造就基 A.3.1 要素 维生素测定用酪卵白氨基酸 12.0 g,葡萄糖 40.0 g,乙酸钠 20.0 g,L-胱氨酸 0.2 g,DL-色氨酸 0.2 g,硫酸腺嘌呤 20.0 mg,盐酸鸟嘌呤 20.0 mg,尿嘧啶 20.0 mg,盐酸硫胺素 2.0 mg,核黄素 2.0 mg, 烟酸 2.0 mg,泛酸钙 2.0 mg,盐酸吡哆醇 4.0 mg,ρ-氨基苯甲酸 200.0 μg,磷酸氢二钾 1.0 g,磷酸二氢 钾 1.0 g, 硫酸镁 0.4 g, 氯化钠 20.0 mg, 硫酸亚铁 20.0 mg, 硫酸锰 20.0 mg, 加水至 1000 mL, pH 6.8±0.2 (25 ℃±5 ℃) 。 A.3.2 制法 将上述要素消融于水中,调理 pH,备用。
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