GB 5413.16-2010发布稿 婴幼儿食物跟乳品中叶酸(叶酸盐活 发布稿.rarGB 5413.16-2010发布稿 婴幼儿食物跟乳品中叶酸(叶酸盐活 发布稿.rar

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中华人平易近共跟国国家规范中华人平易近共跟国国家规范 GB 5413.162010 中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实行 食物僻静国家规范 婴幼儿食物跟乳品中叶酸(叶酸盐活性) 的测定 National food safety standard Determination of folic acid folate activity in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.162010 I 前 言 本规范交流 GB/T 5413.16-1997婴幼儿配方食物跟乳粉 叶酸(叶酸盐活性)测定 。 本规范与GB/T 5413.16-1997比拟,重要变革如下 对磷酸盐缓冲液作了调处; 增加了米粉的处置处分方法; 增加了光密度法测定措施。 本规范所交流规范的历次版本发布状况为 GB 5413-1985、GB/T 5413.16-1997。 GB 5413.162010 1 食物僻静国家规范 婴幼儿食物跟乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定 1 规模 本规范规则了婴幼儿食物跟乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定方法。 本规范适用于婴幼儿食物跟乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定。 2 模范性援用文件 本规范中援用的文件关于本规范的应用是必不可少的。 素日注日期的援用文件, 仅所注日期的版本 适用于本规范。素日不注日期的援用文件,其最新版本(包含全部的修正单)适用于本规范。 3 道理 应用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469 对叶酸的特异性,在含有叶酸的样品中开展孕育产生 的酸度跟组成的光密度来测定叶酸的含量。 4 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为 GB/T 6682 规则的二级水。 4.1 鸡胰腺 称取 100 mg 逝世板的鸡胰腺, 加 20 mL 蒸馏水, 搅拌 15 min, 离心 10 min (3000 转/分钟) , 取上清液,临用前配制。 4.2 0.9 心理盐水称取 9.0 g 氯化钠消融于 1000 mL 水中,分装于具塞试管中,每管 10 mL,121℃ 灭菌 15 min。每周准备一次。 4.3 磷酸盐缓冲液 4.3.1 磷酸盐缓冲液Ⅰ(0.05 mol/L)称取 5.85 g 磷酸二氢钾,1.22 g 磷酸氢二钾,用 1000 mL 水溶 解。临用前按 0.5 g/100 mL 介入抗坏血酸。 4.3.2 磷酸盐缓冲液Ⅱ(用于谷物及谷物制品前处置处分)称取 14.2 g 磷酸氢二钠,用 1000 mL 水消融。 临用前按 1.0 g/100 mL 介入抗坏血酸,用氢氧化钠溶液 A(4.16)调 pH 至 7.8±0.1。 4.3.3 磷酸盐缓冲液 III(用于谷物及谷物制品测试)称取 14.2 g 磷酸氢二钠,用 1000 mL 水消融。 临用前按 1.0 g/100 mL 介入抗坏血酸,用氢氧化钠溶液 A(4.16)调 pH 至 6.8±0.1。 4.3.4 磷酸盐缓冲液Ⅳ(0.1 mol/L)(用于谷物及谷物制品规范溶液制备)消融 13.61 g 磷酸二氢钾 于水中稀释到 1000 mL。用氢氧化钾溶液(4.10)调 pH 至 7.0±0.1。 4.4 叶酸规范品。 4.5 氨水(10.8 )。 4.6 甲苯(C7H8)。 4.7 抗坏血酸(C6H8O6)。 4.8 菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469。 GB 5413.162010 2 4.9 造就基 4.9.1 乳酸杆菌琼脂造就基胨化乳 15 g,酵母浸膏 5 g,葡萄糖 10 g,番茄汁 100 mL,磷酸二氢钾 2 g, 聚山梨糖单油酸酯 1 g, 琼脂 10 g, 加蒸馏水至 1000 mL, 调 pH 至 6.8 ± 0.2 (20 ℃~25 ℃) 。 121℃ 高压灭菌 15min,备用。 4.9.2 乳酸杆菌肉汤造就基胨化乳 15 g,酵母浸膏 5 g,葡萄糖 10 g,番茄汁 100 mL,磷酸二氢钾 2 g,聚山梨糖单油酸酯 1 g,加蒸馏水至 1000 mL,调 pH 至 6.8 ± 0.2(20 ℃~25 ℃)。121℃高压灭 菌 15min,备用。 4.9.3 叶酸测定用造就基酪卵白胨 10 g,葡萄糖 40 g,乙酸钠 40 g,磷酸氢二钾 1 g,磷酸二氢钾 1 g,DL-色氨酸 0.2 g,L-天门冬氨酸 0.6 g,L-半胱氨酸盐酸盐 0.5 g,硫酸腺嘌呤 10 mg,盐酸鸟嘌呤 10 mg,尿嘧啶 10 mg,黄嘌呤 20 mg,聚山梨糖 0.1 g,谷光甘肽 5 mg,硫酸镁 0.4 g,氯化钠 20 mg,硫 酸亚铁 20 mg,硫酸锰 15 mg,核黄素 1 mg,p-氨基苯甲酸 2 mg,维生素 B6 4mg,盐酸硫胺素 400 μg, 泛酸钙 800 μg,烟酸 800 μg,生物素 20 μg,加蒸馏水至 1000 mL,调 pH 至 6.7 ± 0.1(20 ℃~25 ℃)。 注市售商业化分化造就基结果更摇动。 4.10 氢氧化钾溶液(4 mol/L)称取 224 g 氢氧化钾于 1000 mL 烧杯中,用 400 mL 水消融,冷却至 室温后,转移至 1000 mL 容量瓶中,用水定容。 4.11 木瓜卵白酶溶液1 g 卵白酶(生气盼望≥6000 U/mg,pH 6.0 ± 0.1,40 ℃)溶于 100 mL 磷酸盐缓冲 液Ⅰ(4.3.1)中。临用前配制。 4.12 α-淀粉酶溶液1 g α-淀粉酶(1.5 U/mg)溶于 100 mL 磷酸盐缓冲液Ⅰ(4.3.1)中。临用前配制。 4.13 0.22 μm 灭菌滤膜。 4.14 规范溶液的制备 4.14.1 叶酸规范蕴藏液(500 μg/mL)称取 55 mg~56 mg(准确至 0.1 mg)叶酸规范品(4.4),用 50 mL 蒸馏水转入 100 mL 容量瓶中,加 2 mL 氨水(4.5)。溶液制备后,按式(1)算计溶液的体积, 央求蕴藏液中叶酸盐的浓度为 500 μg/mL 蕴藏液体积(mL) 500100 1000 cm 或简化为 蕴藏液体积(mL) 50 cm 1 式中 m叶酸规范品的质量,单元为毫克(mg) ; c叶酸规范品的纯度,单元为克每百克(g/100 g) 。 用水稀释溶液至刻度,用吸管加水至算计央求的体积,充分混杂,放入棕色试剂瓶中 2 ℃~4 ℃冰 箱冷藏,生涯期为 4 个月。 4.14.2 叶酸规范中央液(50 μg/mL)吸取 10 mL 叶酸规范蕴藏液(4.14.1)于 100 mL 棕色容量瓶 中,用水定容至刻度,充分混匀,2 ℃~4 ℃冰箱冷藏,生涯期为 1 个月。 4.14.3 叶酸规范变乱液(0.05 ng/mL,0.1 ng/mL)吸取 1 mL 叶酸规范中央液(4.14.2)于 100 mL 棕色容量瓶中,用水定容至刻度,混杂。再吸该液 1 mL 于 100 mL 棕色容量瓶中,定容,混杂。 从上 液中区分吸取 5 mL 于 250 mL 跟 500 mL 棕色容量瓶中, 用磷酸盐缓冲液Ⅰ (4.3.1) 定容到刻度, 混匀, 即为高浓度规范变乱液(0.1 ng/mL)跟低浓度规范变乱液(0.05 ng/mL)。临用前配制。 4.15 盐酸(1 mol/L)量取 83.0 mL 盐酸溶于水中,冷却后定容至 1000 mL。 GB 5413.162010 3 4.16 氢氧化钠溶液 A(4 mol/L)称取 160 g 氢氧化钠于 1000 mL 烧杯中,用 400 mL 水消融,冷却 至室温后,转移至 1000 mL 容量瓶中,用水定容。 4.17 氢氧化钠溶液 B(0.1 mol/L)吸取 2.5 mL 氢氧化钠溶液 A(4.16)转移至 100 mL 容量瓶顶用 水定容。 4.18 氢氧化钠规范滴定溶液(0.1 mol/L ± 0.0002 mol/L)称取 4 g(准确至 0.0001 g)氢氧化钠用水 稀释至 1000 mL,用邻苯二甲酸氢钾标定。生涯此溶液的容器要密封,以防二氧化碳浸透排泄。 4.18.1 氢氧化钠规范溶液的标定称取约 0.18 g(准确至 0.0001 g)于 105 ℃~110 ℃烘至恒重的邻 苯二甲酸氢钾,用 50 mL 除二氧化碳的水溶于锥形瓶中,加两滴 5 g/L 的酚酞唆使剂,用配好的氢氧化 钠溶液滴定至粉赤色,同时作空白实行。按式(2)算计氢氧化钠规范溶液的浓度 c 2042. 0 m 21 ?VV 2 式中 c氢氧化钠的浓度,单元为摩尔每升(mol/L) ; m称取的邻苯二甲酸氢钾的质量,单元为克(g) ; V1氢氧化钠溶液的用量,单元为毫升(mL) ; V2空白试验氢氧化钠溶液的用量,单元为毫升(mL) 。 4.18.2 酚酞溶液取 0.5 g 酚酞溶于 75 mL 体积分数为 95 的乙醇中,介入 20 mL 水,再介入氢氧 化钠溶液(4.18),直至介入一滴立刻酿成粉赤色,再用水定容至 100 mL。 4.19 溴麝喷鼻草酚蓝唆使剂称取 0.1 g 溴麝喷鼻草酚蓝于研钵中,介入 1.6 mL 氢氧化钠溶液 B(4.17) 研磨,加少许水至完好消融,转移至 250 mL 容量瓶顶用水定容。 5 仪器跟设备 5.1 pH 计精度为 0.01。 5.2 离心计心情转速≥2000 转/分钟。 5.3 分光光度仪。 5.4 天平感量为 0.1 mg。 5.5 生化造就箱36 ℃±1 ℃ 5.6 滴定管分刻度值为 0.1 mL。 5.7 涡旋振荡器。 6 剖析措施 6.1 测试菌液的制备 6.1.1 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei) ATCC 7469 冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤造就基 (4.9.2) 中, 36 ℃±1 ℃造就 24 h 后,转接至乳酸杆菌琼脂造就基(4.9.1)试管中,再 36 ℃ ±1 ℃造就 24 h。造就好的 乳酸杆菌琼脂造就基(4.9.1)试管的造就物作为蕴藏菌种。 GB 5413.162010 4 6.1.2 从蕴藏菌种造就基上区分转接到三个乳酸杆菌琼脂造就基 (4.9.1) 试管中, 放入造就箱中 36 ℃±1 ℃造就 24 h。每月转接一次,作为月接种管贮于冰箱中。每月活期从月接种管中从新接种 3 个转担负保 存新菌株。 6.1.3 从月接种的造就管中的一支再接种一支乳酸杆菌琼脂造就基 (4.9.1) 试管, 36 ℃±1 ℃造就 24 h, 作为日接种管每日测定用。 6.1.4 从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤造就基(4.9.2),36 ℃±1 ℃造就 24 h。在无菌前提下离 心该造就液 10 min (2000 转/分钟) , 弃去上清液。 用 10 mL 心理盐水 (4.2) 振荡洗迓洫菌体, 离心 10 min (2000 转/分钟),弃去上清液,用 10 mL 心理盐水(4.2)振荡洗迓洫。如前离心支配,弃去上清液。再 加 10 mL 心理盐水(4.2),混匀。吸 1 mL 该菌悬液于 10 mL 心理盐水(4.2)中,混匀制成测试菌液。 6.1.5 以心理盐水(4.2)做比照,用分光光度计,于 550 nm 波长下,测测试菌液(6.1.4)的光密度 值,此值应在 60 ~80 之间。 6.2 试样的制备 6.2.1 乳制品 称取 2 g(准确至 0.0001 g)试样(约含叶酸 5 μg)于 100 mL 烧杯中,用 25 mL~30 mL 水复兴复兴样 品,转入 100 mL 容量瓶中,用水定容至刻度,溶液中叶酸的质量浓度大约为 0.05 μg/mL。吸取 1 mL 该样液跟 1 mL 鸡胰腺(4.1)于一个 180 mm15 mm 的带螺旋盖的试管中,充分混杂。加 18 mL 含抗 坏血酸的磷酸缓冲液Ⅰ(4.3.1) ,再加 1 mL 甲苯(4.6) 。同时制备±空白比照管,吸 1 mL 蒸馏水跟 1 mL 鸡胰腺(4.1)于空白管中,加 18 mL 含抗坏血酸的磷酸缓冲液Ⅰ(4.3.1)及 1 mL 甲苯(4.6) 。在 37 ℃ 下,样品管跟空白管保温 16 h 后,于 100 ℃水浴加热 5 min。用磷酸盐缓冲液Ⅰ(4.3.1)作妥当稀释, 掉掉浓度约为 0.1 ng/mL 的叶酸盐溶液。 若确定样品中强化叶酸与原生叶酸比拟所占比例很年夜, 则可以用 1 mL 样液加 19 mL 含抗坏血酸的 磷酸缓冲液Ⅰ(4.3.1)于 100 ℃水浴加热 5 min,再用磷酸盐缓冲液Ⅰ(4.3.1)稀释,掉掉浓度约为 0.1 ng/mL 的叶酸盐溶液。 6.2.2 谷物及谷物制品 称取大约含 1 μg 叶酸的试样于 150 mL 三角烧瓶中。加 20 mL pH 7.8 磷酸缓冲溶液Ⅱ(4.3.2) ,混 匀后加 50 mL 水跟 1.0 mL 甲苯(4.6) 。加盖后 121 ℃ 15 min 灭菌,然后矫捷冷却。加 1 mL 木瓜卵白 酶溶液(4.11) ,于 36 ℃±1 ℃保温 3h 后 100 ℃加热 3 min,冷却。加 1 mL α-淀粉酶溶液(4.12) ,36 ℃ ±1 ℃保温 2 h 后加 4 mL 鸡胰腺 (4.1) , 加盖, 36 ℃ ± 1℃保温 16 h 后 100 ℃加热 3 min, 冷却。 用 1 mol/L 盐酸(4.15)调 pH 至 4.5,用水稀释定容到 100 mL。过滤掉掉廓清滤液,然后吸取 1 mL 廓清滤液用磷 酸盐缓冲液 III(4.3.3)定容至 100 mL,掉掉浓度约为 0.1 ng/mL 的叶酸盐溶液。 若确定样品中强化叶酸与原生叶酸比拟所占比例很年夜则可以直接在样品中加 20 mL 0.05 mol/L 含 抗坏血酸的磷酸缓冲液Ⅱ(4.3.2)跟 50 mL 水,于 121 ℃灭菌 15 min,然后吸取 1mL 廓清滤液,再用 0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液 III(4.3.3)稀释,掉掉浓度约为 0.1 ng/mL 的叶酸盐溶液。 6.3 规范曲线管的制作 按表 1 次序递次介入蒸馏水、规范变乱液(4.14.3) (测定谷物及谷物制品的规范溶液用磷酸盐缓冲液Ⅳ (4.3.4)交流磷酸盐缓冲液Ⅰ(4.3.1) )跟叶酸测定用造就基(4.9.3)于造就管中。表 1 中每一编号需 制作 3 管。试管 S2 至 S10 中,相当叶酸含量为 0.00 ng、0.05 ng、0.10 ng、0.15 ng 、0.20 ng、0.25 ng、 0.30 ng、0.40 ng、0.50 ng。 GB 5413.162010 5 表 1 规范曲线管的制作 试管号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 蒸馏水(mL) 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 规范溶液(mL) 0 0 1 2 3 4 5 3 4 5 造就基(mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 注 1试管 S3~S7 中加低浓度规范变乱液。 注 2试管 S8~S10 中加高浓度规范变乱液。 6.4 试样管的制作 按表 2 次序递次介入蒸馏水、试样跟叶酸测定用造就基于试管中,表中每一编号需制作 3 管。 表 2 试样管的制作 试管号 1 2 3 4 蒸馏水(mL) 4 3 2 1 样 品(mL) 1 2 3 4 造就基(mL) 5 5 5 5 6.5 灭菌 将规范曲线管跟试样管 121 ℃灭菌 5 min,矫捷冷却到室温(商品化造就基按标签说明举行灭菌。 注包管加热跟冷却过程中前提平均,灭菌管数过多或距离太近,在灭菌锅中都可孕育产生不良影响。 6.6 接种 无菌前提下每管中均介入一滴(约 50 μL)菌悬液(6.1.4) ,加盖,充分振荡混匀全部试管(规范 曲线未接种空白管 S1 除外) 。 6.7 造就 6.7.1 酸度法36 ℃ ± 1 ℃造就 72 h。对每支试管举行奶镡搜索,未接种管内造就液应是廓清的,标 准曲线管跟试样管中造就液的浊度应有梯度。未接种管中若出现混浊,则测定有用。 6.7.2 光密度法在 36 ℃ ± 1 ℃,造就 16 h~24 h。其他同 6.7.1。 6.8 测定 6.8.1 酸度法 6.8.1.1 用 10 mL 水将未接种空白管 S1 跟接种空白管 S2 的造就物转至三角烧瓶中, 以溴麝喷鼻草酚蓝 (4.19)作唆使剂,或用 pH 计以 pH 6.8 ± 0.2 为滴定止境用氢氧化钠规范滴定溶液(4.18)滴定例范曲 线未接种空白管 S 1 跟接种空白管 S 2。记载下消耗的氢氧化钠规范滴定溶液体积。 注 假如接种空白滴定回声消耗的氢氧化钠规范滴定溶液体积数就是或高于未接种空白水平的 1.5 mL, 则测定结果 有用。 6.8.1.2 用 10 mL 水将规范曲线管跟试样管中的造就物转至三角烧瓶中,以溴麝喷鼻草酚蓝(4.19)作 唆使剂,或用 pH 计以 pH 6.8 ± 0.2 为滴定止境用氢氧化钠规范滴定溶液(4.18.1)滴定例范曲线管跟试 样管的造就物。记载下消耗的氢氧化钠规范滴定溶液体积。 注通惯例范曲线管 S7 消耗的 0.1 mol/L 的氢氧化钠规范滴定溶液体积数在 8 mL~12 mL 之间。 6.8.2 光密度法 GB 5413.162010 6 以接种空白管 (表 1 中试管号 S 2) 作比照, 掏出最高浓度规范曲线管 S7, 振荡 5 s, 在波长 550 nm 下读取光密度值,放回从新造就。2 h 后整齐前提从新测该管的光密度,假如两次光密度的相对差结果 ≤2 ,则掏出全部检验管测定例范溶液跟试样的光密度。 6.9 规范曲线的绘制 以规范曲线管叶酸含量作横坐标, 以消耗氢氧化钠规范滴定溶液的毫升数或光密度值为纵坐标绘制 规范曲线。 6.10 试样管中叶酸含量的算计 依据 13.8 每个试样管测定的消耗氢氧化钠规范滴定溶液的毫升数或光密度值,从规范曲线中查得 对应的叶酸含量。每一编号的三个试样管应算计管中每毫升测定液叶酸的含量,并与其平均值相比照。 相对缺陷小于 15 的试管为有用试管,有用试样管应舍去,有用试样管总数应年夜于全部试样管总数的 2/3。从新算计每一编号的有用试样管中每毫升测定液叶酸含量的平均值,以此平均值算计全部编号试 样管的总平均值 Cx。 注样品管中叶酸含量低于 0.05 ng,高于 0.5 ng 的值应舍去。 7 剖析结果的表述 试样中叶酸含量按式(3)算计 X= m EBDCx 1000 100 ][?(3) 式中 X试样中叶酸含量,单元为微克每百克(μg/100 g) ; Cx6.10 中算计所得的总平均值,单元为纳克(ng) ; D样品在处置处分后的稀释因子; EB鸡胰腺空白管中叶酸含量,单元为纳克每毫升(ng/mL) ; m样品的质量或体积,单元为克(g) 。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管三位有用数字。 8 精致度 在重复性前提下掉掉的两次自力测试结果的相对差值不逾越跨过算术平均值的 10 。 9 其他 本规范检出限为 2 μg/100g。
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