GB 5413.25-2010发布稿 婴幼儿食物跟乳品中肌醇的测定 发布稿.rarGB 5413.25-2010发布稿 婴幼儿食物跟乳品中肌醇的测定 发布稿.rar

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中华人平易近共跟国国家规范中华人平易近共跟国国家规范 GB 5413.252010 中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实行 食物僻静国家规范 婴幼儿食物跟乳品中肌醇的测定 National food safety standard Determination of inositol in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.252010 I 前 言 本规范交流GB/T 5413.25-1997婴幼儿配方食物跟乳粉 肌醇的测定。 本规范与GB/T 5413.25-1997比拟,第一法重要变革如下 对菌种珍藏造就基举行了改正; 试样处置处分由盐酸蒸馏法改为盐酸高压水解法; 菌种接种措施由菌液与造就基混杂后分装试管改为菌液向试管中滴加法; 对规范变乱溶液的浓度做了调处; 灭菌温度由100 ℃调处为121 ℃; 明确了控制接种菌悬液浓度的请乞降方法; 进步了算计公式的适用性; 增加了检出限。 第二法重要变革如下 采用肌醇硅烷化衍生法; 增加了检出限。 本规范的附录A跟附录B为资料性附录。 本规范所交流规范的历次版本发布状况为 GB 5413-1985、GB/T 5413.25-1997。 GB 5413.252010 1 食物僻静国家规范 婴幼儿食物跟乳品中肌醇的测定 1 规模 本规范规则了婴幼儿食物跟乳品中肌醇的测定方法。 本规范适用于婴幼儿食物跟乳品中肌醇的测定。 2 模范性援用文件 本规范中援用的文件关于本规范的应用是必不可少的。素日注日期的援用文件,仅所注日期的版 本适用于本规范。素日不注日期的援用文件,其最新版本(包含全部的修正单)适用于本规范。 第一法 微生物法 3 道理 应用葡萄汁酵母菌(Saccharomyces uvarum)对肌醇的特异性跟敏锐性,定量测定出试样中待测 物资的含量。在含有除待测物资以外全部营养要素的造就基中,微生物的开展与待测物资含量呈线性 干系,依据透光率与规范变乱曲线举行比照,即可算计出试样中待测物资的含量。 4 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为 GB/T 6682 规则的二级水。 4.1 菌株葡萄汁酵母菌(Saccharomyces uvarum),ATCC 9080。 4.2 肌醇(myo-Inositol)规范品分子式 C6H12O6,纯度≥99 。 4.3 氯化钠(NaCl)。 4.4 氢氧化钠(NaOH)。 4.5 造就基 4.5.1 麦芽浸粉琼脂造就基(Malt Extract Agar)拜见附录 A。 4.5.2 肌醇测定造就基拜见附录 A。 4.6 氯化钠溶液(9 g/L)称取 9.0 g 氯化钠消融于 1000 mL 水中,分装试管,每管 10 mL。121℃ 灭菌 15 min。 4.7 盐酸(1 mol/L)量取 82.0 mL 盐酸溶于水中,冷却后定容至 1000 mL。 4.8 盐酸(0.44 mol/L)量取 36.6 mL 盐酸溶于水中,冷却后定容至 1000 mL。 4.9 氢氧化钠溶液(600 g/L)称取 300 g 氢氧化钠消融于水中,冷却后定容至 500 mL。 4.10 氢氧化钠溶液(1 mol/L)称取 40 g 氢氧化钠消融于水中,冷却后定容至 1000 mL。 GB 5413.252010 2 4.11 肌醇规范溶液 4.11.1 肌醇规范蕴藏液(0.2 mg/mL)肌醇规范品置于装有五氧化二磷的逝世板器中逝世板 24 h 以上, 称取 50 mg 肌醇规范品(4.2)(准确到 0.1 mg),用水充分消融,定容至 250 mL,贮存于冰箱中。 4.11.2 肌醇规范中央液(10 ?g/mL)吸取 5 mL 肌醇规范蕴藏液(4.11.1)用水定容到 100 mL, 贮存于冰箱。 4.11.3 肌醇规范变乱液(1 ?g/mL 跟 2 ?g/mL)吸取 10 mL 肌醇规范中央液(4.11.2)两次,区分 用水定容到 100 mL 跟 50 mL。该变乱液需每次临用前配制。 4.12 逝世板剂五氧化二磷(P2O5)。 4.13 玻璃珠直径约 5 mm。 5 仪器跟设备 除微生物实行室常规灭菌及造就设备外,其他设备跟原料如下 5.1 天平感量为 0.1 mg。 5.2 pH 计精度≤0.02。 5.3 分光光度计。 5.4 涡旋混杂器。 5.5 离心计心情转速≥2000 转/分钟。 5.6 恒温造就箱30 ℃ ±1 ℃。 5.7 振荡造就箱30 ℃ ±1 ℃,振荡速度 140 次/min~160 次/min。 5.8 冰箱2 ℃~5 ℃。 5.9 无菌吸管10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器或吸头。 5.10 瓶口分液器0 mL~10 mL。 5.11 锥形瓶200 mL。 5.12 容量瓶(A 类)100 mL ,250 mL, 500 mL。 5.13 单刻度移液管(A 类)容量 5 mL。 5.14 漏斗直径 90 mm。 5.15 定量滤纸直径 90 mm。 5.16 试管18 mm 180 mm。 注玻璃仪器应用前,用活性剂对硬玻璃测定管及其他需求的玻璃器皿举行洗迓洫,洗迓洫之后在 200 ℃干热 2 h。 6 剖析措施 6.1 接种菌悬液的制备 GB 5413.252010 3 6.1.1 菌种清醒 将菌株(4.1)活化后接种到麦芽浸粉琼脂斜面造就基(4.5.1)上,30 ±1℃ ℃造就 16 h~24 h 后, 再转接 2 代~3 代来增强生气盼望,制成蕴藏菌种,贮于冰箱(8.5)中,生涯期不要逾越跨过 2 周。临用前接 种到新的麦芽浸粉琼脂斜面造就基上。 6.1.2 接种菌悬液的制备 在应用的前一天将蕴藏菌种转接到新配制的麦芽浸粉琼脂斜面造就基上,于 30 ℃±1 ℃造就 16 h~24 h。 用接种环刮取菌苔到一支灭菌氯化钠溶液 (4.6) 试管中。 以 2000 转/分钟离心 2 min~3 min, 倾出上清液,介入 10 mL 氯化钠溶液(4.6) ,振荡混匀,再离心 2 min~3 min,如此洗迓洫 3 次~4 次。 吸取必定量的该菌液移入装有 10 mL 氯化钠溶液(4.6)的试管中,制成接种菌悬液。 用分光光度计,以氯化钠溶液(4.6)作空白,550 nm 波长下测定该接种菌悬液的透光率,调处 介入的菌液量大约介入必定量的氯化钠溶液使该菌悬腋腹饴试 60 ~80 。 6.2 试样的处置处分 6.2.1 称取约含肌醇 0.5 mg~2.0 mg 的试样(准确至 0.1 mg)于 250 mL 三角瓶中,关于干粉试样加 入 80 mL 盐酸(4.8),关于液体试样介入 100 mL 盐酸(4.8),混匀,使干粉试样消融。 6.2.2 将三角瓶以铝箔纸突围,在灭菌釜中 125 ℃消化 1 h。掏出,冷却至室温,介入约 2 mL 氢氧 化钠溶液(4.9),冷却。用氢氧化钠溶液(4.10)或盐酸溶液(4.7)调 pH 至 5.2,转入 250 mL 容量 瓶中,定容至刻度。混匀,过滤,搜集滤液,该滤液为待测液。调处稀释度,使待测液肌醇的浓度在 1 ?g/mL~10 ?g/mL 规模内。 6.3 规范曲线的制作 按表 1 次序递次介入蒸馏水、肌醇规范变乱液(4.11.3)跟肌醇测定造就基(4.5.2)于造就管中,一式 三份。 表1 规范曲线的制作 试管号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 蒸馏水(mL) 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 肌醇规范变乱液 1 ?g/mL(mL) 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 肌醇规范变乱液 2 ?g/mL(mL) 0 0 0 0 0 0 0 3 4 5 造就基(mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6.4 待测液的制作 按表 2 次序递次介入蒸馏水、待测液(6.2.2)跟肌醇测定造就基(4.5.2)于造就管中,一式三份。 表2 待测液的制作 试管号 1 2 3 4 蒸馏水(mL) 4 3 2 1 待测液(mL) 1 2 3 4 造就基(mL) 5 5 5 5 6.5 灭菌 GB 5413.252010 4 每支试管内介入一粒玻璃珠(4.13) ,盖上试管帽,121 ℃灭菌 5 min(商品造就基按标签说明进 行灭菌) 。 6.6 接种 将上述试管矫捷冷却至 30 ℃以下。用滴管或移液器向上述试管中各滴加一滴(约 50 ?L)接种菌 悬液(6.1.2) ,其中规范曲线管中的接种空白试管 S1 除外。 6.7 造就 将试管硬朗在振荡造就箱内,用约 140 次/min~160 次/min 的振荡速度,在 30 ℃ ±1 ℃振荡造就 22 h~24 h。 6.8 测定 对每支试管举行视觉搜索,接种空白试管 S1 内造就液应是廓清的,假如出现混浊,则结果有用。 6.8.1 从振荡造就箱内掏出试管,放入灭菌釜内,100 ℃坚持 5 min,使微生物抑止开展。 6.8.2 用接种空白试管 S1(6.3)作空白,将分光光度计透光率调到 100 (或吸光度 A 为 0),读 出接种空白试管 S2(6.3)的读数。再以接种空白试管 S2 为空白,调理透光率为 100 (或 A 为 0), 依次读出其他每支试管的透光率(或吸光度 A)。 6.8.3 用涡旋混杂器充分混杂每一支试管(也可以加一滴消泡剂)后,立刻将造就液移入比色皿内进 行测定,波长为 540 nm~660 nm,待读数摇动 30 s 后,读出透光率,每支试管摇动时间要相同。以肌 醇规范品的含量为横坐标,透光率为纵坐标作规范曲线。 6.8.4 依据待测液的透光率, 从规范曲线中查得该待测液中肌醇的浓度, 再依据稀释因子跟称样量计 算出试样中肌醇的含量。透光率逾越跨过规范曲线管 S3~S10 规模的试样管要舍去。 6.8.5 对每个编号的待测液的试管, 用每支试管的透光率算计每毫升该编号待测液肌醇的浓度, 并计 算该编号待测液的肌醇浓度平均值,每支试管测得的该浓度不得逾越跨过该平均值的±15 ,逾越跨过者要舍 去。假如契合该央求的管数少于全部的四个编号的待测液的总管数的 2/3,用于算计试样含量的数据 是不充分的, 需求从新检验。假如契合央求的管数逾越跨过本来管数的 2/3,从新算计每一编号的有用试样 管中每毫升测定液肌醇含量的平均值,以此平均值算计全部编号试样管的总平均值 Cx,用于算计试样 中的肌醇含量。 注 绘制规范曲线,既可读取透光率(T ) ,也可读取吸光度(A) 。 7 剖析结果的表述 试样中肌醇的含量按式1算计 100 1000 f m C X x 1 式中 X试样中肌醇的含量,单元为毫克每百克(mg/100 g) ; Cx6.8.5 中算计所得的总平均值,单元为微克(?g) ; m试样的质量,单元为克(g) ; f稀释倍数。婴幼儿食物跟乳品 f 为 250。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管三位有用数字。 8 精致度 GB 5413.252010 5 在重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的相对差值不得逾越跨过算术平均值的10 。 第二法 气相色谱法 9 道理 试样中的肌醇用水跟乙醇提取后,与硅烷化试剂衍生,正几樘崛。经气相色谱疏散,外标法定 量。 10 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为 GB/T 6682 规则的一级水。 10.1 无水乙醇C2H6O。 10.2 正几镃6H14。 10.3 乙醇(95 )。 10.4 乙醇(70 )。 10.5 三甲基氯硅烷C3H9ClSi。 10.6 六甲基二硅胺烷C6H19NSi2。 10.7 N,N-二甲基甲酰胺C3H7NO。 10.8 硅烷化试剂区分吸取体积比为 128 的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N,N-二甲基甲 酰胺,超声混匀,临用前配制。 10.9 肌醇规范品纯度≥99 。 10.10 肌醇规范溶液(0.010 mg/mL)称取 100 mg(准确至 0.1 mg)经过 105 ±1 ℃℃烘干 2 h 的 肌醇规范品(10.9)于 100 mL 容量瓶中,用 25 mL 水消融完好。用乙醇(10.3)定容至刻度,混匀。 取 1 mL 此溶液于 100 mL 容量瓶中,用乙醇(10.4)定容至刻度,混匀。 11 仪器跟设备 11.1 天平感量为 0.1 mg。 11.2 气相色谱仪,带 FID 检测器。 11.3 离心计心情转速≥5000 转/分钟。 11.4 改动蒸发仪。 11.5 超声波洗迓洫器。 11.6 恒温热水浴槽。 11.7 带有罗纹盖的 25 mL 试管。 12 剖析措施 GB 5413.252010 6 12.1 试样处置处分与衍生 12.1.1 试样处置处分 固体试样混杂平均后称取 1 g (准确至 0.0001 g) , 于 50 mL 容量瓶中, 介入 12 mL 约 40 ℃温水消融试样;液体试样直接称取 12 g(准确至 0.0001 g)于 50 mL 容量瓶中。上述试样超声 提取约 10 min,用乙醇(10.3)定容至刻度,混匀。静置约 20 min 后,取 10 mL 于 15 mL 离心管中, 以不低于 4000 转/分钟离心约 5 min。取上清液 5 mL 于改动蒸发仪稀释瓶中。 12.1.2 逝世板与衍生向稀释瓶中介入 10 mL 无水乙醇(10.1),在 80 ℃ ±2 ℃下改动稀释至近干时 再介入 5mL 无水乙醇(10.1)连续稀释至彻底逝世板(有水将使下步硅烷化不彻底)。介入硅烷化试剂 (10.8)10 mL,超声消融 5 min 并转移至 25 mL 有螺纹盖的离心管中,放于 80 ℃±2 ℃水浴中衍生反 应约 75 min,时期每隔约 20 min 掏出震动一次,然后掏出冷却至室温。介入 5mL 正几椋10.2),振 荡混杂后运动分层。取下层液 3 mL 于事后加少许无水硫酸钠的带螺纹盖离心管中,振荡后以不低于 4000 转/分钟离心,此为试样测定液。 12.2 规范测定液的制备 区分吸取 0.0 mL,2.0 mL,4.0 mL,6.0 mL,8.0 mL,10.0 mL 肌醇规范溶液(10.10)于稀释瓶 中,按 12.1.2 措施支配。 12.3 测定 12.3.1 参考色谱前提 色谱柱 填料为 50 氰丙基-甲基聚硅氧烷的毛细管柱 (柱长 60 m, 内径 0.25 mm,膜厚 0.25 ?m) 或整齐功用的色谱柱。 进样口温度280 ℃。 检测器温度300 ℃。 分流比101。 进样量1.0 μL。 措施升温见表 3 表 3 措施升温 升温速度(/ min℃) 温度(℃) 连续时间(min) 120 0 10 190 50 10 220 3 12.3.2 规范曲线制作 区分将规范溶液测定液(12.2)注入到气相色谱仪中(色谱图拜见附录 B) ,以测得的峰面积(或 峰高)为纵坐标,以肌醇规范测定液中肌醇的含量为横坐标制作规范曲线。 12.3.3 试样溶液的测定 区分将试样测定液(12.1.2)注入到气相色谱仪中掉掉峰面积(或峰高) ,从规范曲线中掉掉试样 测定液中肌醇的含量(mg)。 13 剖析结果的表述 试样中肌醇含量按式2算计 100 i is m fC X 2 GB 5413.252010 7 式中 X试样中肌醇含量,单元为毫克每百克(mg/100 g) ; Cs从规范曲线中掉掉试样测定液肌醇的含量,单元为毫克(mg) 。 mi试样的质量,单元为克(g)。 fi试样测定液所含肌醇换算成试样中所含肌醇的系数为 10。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管三位有用数字。 14 精致度 在重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的相对差值不得逾越跨过算术平均值的10 。 15 其他 本规范第一法、第二法检出限均为 2.0 mg/100 g。 GB 5413.252010 8 附录 A (模范性附录) 造就基跟试剂 A.1 麦芽浸粉琼脂造就基(Malt Extract Agar) A.1.1 要素 麦芽糖 12.75 g, 糊精 2.75 g, 丙三醇 2.35 g, 卵白胨 0.78 g, 琼脂 15.0 g, 蒸馏水 1000 mL, pH 4.7±0.2 25 ±5 ℃℃。 A.1.2 制法 先将除琼脂以外的其他要素消融于蒸馏水中,调理 pH,再介入琼脂,加热煮沸,使琼脂熔解。混 合平均后分装试管,每管 10 mL。121 ℃高压灭菌 15 min,摆成斜面备用。 A.2 肌醇测定造就基 A.2.1 要素 葡萄糖 100 g,柠檬酸钾 10 g,柠檬酸 2 g,磷酸二氢钾 1.1 g,氯化钾 0.85 g,硫酸镁 0.25 g,氯 化钙 0.25 g,硫酸锰 50 mg,氯化亚铁 50 mg,DL-色氨酸 80 mg,L-胱氨酸 0.1 g,L-异亮氨酸 0.5 g, L-亮氨酸 0.5 g ,L-赖氨酸 0.5 g,L-蛋氨酸 0.2 g,DL-苯基丙氨酸 0.2 g,L-酪氨酸 0.2 g,L-天门冬氨 酸 0.8 g,DL-天门冬氨酸 0.2 g,DL-丝氨酸 0.1 g,甘氨酸 0.2 g,DL-苏氨酸 0.4 g,L-缬氨酸 0.5 g, L-组氨酸 0.124 g,L-脯氨酸 0.2 g,DL-丙氨酸 0.4 g,L-谷氨酸 0.6 g,L-精氨酸 0.48 g,盐酸硫胺素 500 ?g,生物素 16 ?g,泛酸钙 5 mg,盐酸吡哆醇 1 mg,蒸馏水 1000 mL,pH 5.2±0.2(25 ±5 ℃℃) 。 A.2.2 制法 将上述要素消融于水中,调理 pH,备用。 注一些商品化分化造就基结果优秀,商品化分化造就基按标签说明举行配制。 GB 5413.252010 9 附录 B (资料性附录) 肌醇规范衍生物气相色谱图 B.1 肌醇规范衍生物气相色谱图 肌醇规范衍生物气相色谱图 B.1。 图 B.1 肌醇规范品衍生物气相色谱图
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