GB 5413.17-2010发布稿 婴幼儿食物跟乳品中泛酸的测定 发布稿.rarGB 5413.17-2010发布稿 婴幼儿食物跟乳品中泛酸的测定 发布稿.rar

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中华人平易近共跟国国家规范中华人平易近共跟国国家规范 GB 5413.172010 中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实行 食物僻静国家规范 婴幼儿食物跟乳品中泛酸的测定 National food safety standard Determination of pantothenic acid in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.172010 I 前 言 本规范第一法为分歧采用国际剖析财学会(AOAC)945.74 Pantothenic Acid in Vitamin Preparations。 本规范交流GB/T 5413.17-1997婴幼儿配方食物跟乳粉 泛酸的测定。 本规范与GB/T 5413.17-1997比拟,第一法重要变革如下 增加了 tris 缓冲液配制方法; 确定了测定波长; 增加了规范曲线绘制的笔墨描写。 第二法重要变革如下 交流了色谱柱; 变卦了运动相; 增加了含淀粉类试样举行酶解的处置处分方法。 本规范的附录A为资料性附录。 本规范所交流规范的历次版本发布状况为 GB 5413-1985、GB/T 5413.17-1997。 GB 5413.172010 1 食物僻静国家规范 婴幼儿食物跟乳品中泛酸的测定 1 规模 本规范规则了婴幼儿食物跟乳品中泛酸的测定方法。 本规范适用于婴幼儿食物跟乳品中泛酸的测定。 2 模范性援用文件 本规范中援用的文件关于本规范的应用是必不可少的。 素日注日期的援用文件, 仅所注日期的版本 适用于本规范。素日不注日期的援用文件,其最新版本(包含全部的修正单)适用于本规范。 第一法 微生物法 3 道理 应用动物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC 8014 对泛酸的特异性,在含有泛酸样品中开展产 生的酸度跟组成的光密度来测定泛酸的含量。 4 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯试剂,水为 GB/T 6682 规则的二级水。 4.1 0.9 心理盐水9.0 g 氯化钠消融于 1000 mL 水中,分装于具塞试管中,每管 10 mL,121 ℃灭菌 15 min。每周准备一次。 4.2 泛酸钙规范品。 4.3 乙酸溶液(0.2 mol/L)吸取 12 mL 冰乙酸用水稀释至 1000 mL。 4.4 甲苯(C7H8)。 4.5 乙酸钠溶液(0.2 mol/L)消融 16.4 g 无水乙酸钠于水中,稀释至 1000 mL。 4.6 菌株动物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC 8014。 4.7 造就基 4.7.1 乳酸杆菌琼脂造就基光解胨 15 g,酵母浸膏 5 g,葡萄糖 10 g,番茄汁 100 mL,磷酸二氢钾 2 g,聚山梨糖单油酸酯 1 g,琼脂 10 g,加蒸馏水至 1000 mL,调 pH 至 6.8 ± 0.2(20 ℃~25 ℃)。 4.7.2 乳酸杆菌肉汤造就基光解胨 15 g,酵母浸膏 5 g,葡萄糖 10 g,番茄汁 100 mL,磷酸二氢钾 2 g,聚山梨糖单油酸酯 1 g,加蒸馏水至 1000 mL,调 pH 至 6.8 ±0.2(20 ℃~25℃)。 4.7.3 泛酸测定用造就基葡萄糖 40 g,乙酸钠 20 g,无维生素酸水解酪卵白 10 g,磷酸氢二钾 1 g, 磷酸二氢钾 1 g,L-胱氨酸 0.4 g,L-色氨酸 0.1 g,硫酸镁 0.4 g,氯化钠 20 mg,硫酸亚铁 20 mg,硫酸 锰 20 mg, 硫酸腺嘌呤 20 mg, 盐酸鸟嘌呤 20 mg, 尿嘧啶 20 mg, 胡萝卜素 400 μg, 盐酸硫胺素 200 μg, GB 5413.172010 2 生物素 0.8 μg,p-氨基苯甲酸 200 μg,烟酸 1 mg,盐酸吡哆醇 800 μg,聚山梨糖单油酸酯 0.1 g,加蒸 馏水至 1000 mL,调 pH 至 6.7±0.1(20 ℃~25 ℃)。 4.8 Tris 缓冲液称取 24.2 g Trizma Base 于烧杯中,加 200 mL 水消融。 4.9 盐酸(0.1 mol/L)吸取 8.3 mL 盐酸,用水稀释至 1000 mL。 4.10 规范溶液 4.10.1 泛酸规范蕴藏液(40 μg/mL)准确称取 45 mg~55 mg 泛酸钙规范品(4.2),溶入 500 mL 蒸馏水中,加 10 mL 乙酸溶液 (4.3),加 100 mL 乙酸钠溶液(4.5),用水稀释至泛酸钙准确浓度为 43.47 μg/mL(即泛酸浓度为 40 μg/mL),加 0.5 mL 甲苯(4.4)贮于 2 ℃~4 ℃冰箱中,生涯期为 4 个月。 4.10.2 泛酸中央蕴藏液(1 μg/mL)取 25 mL 规范蕴藏液(4.10.1),介入蒸馏水 500 mL,乙酸溶 液 10 mL(4.3),乙酸钠溶液 100 mL(4.5),再用水稀释至 1 L。加 0.5 mL 甲苯(4.4)贮于冰箱中(2 ℃~4 ℃),生涯期为 1 个月。 4.10.3 泛酸规范变乱液(10 ng/mL,5 ng/mL)吸两次 5.0 mL 中央蕴藏液(4.10.2),区分用水定 容至 500 mL 跟 1000 mL,临用前配制。 5 仪器跟设备 5.1 分光光度仪。 5.2 pH 计精度为 0.01。 5.3 涡旋振荡器。 5.4 天平感量 0.1 mg。 5.5 生化造就箱36 ℃ ± 0.5 ℃。 5.6 离心计心情转速≥2000 转/分钟。 6 剖析措施 6.1 测试菌液的制备 6.1.1 把动物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC 8014 冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤造就基(4.7.2) 试管中,36 ℃ ± 1 ℃造就 24 h。再转接至乳酸杆菌琼脂造就基(4.7.1)试管中,36 ℃ ± 1 ℃造就 24 h。 造就好的乳酸杆菌琼脂造就基(4.7.1)试管的造就物作为蕴藏菌种。 6.1.2 从蕴藏菌种造就基上区分转接到三个乳酸杆菌琼脂造就基(4.7.1)试管中,放入造就箱中 36 ℃ ± 1 ℃造就 24 h。每月转接一次,作为月接种管贮于冰箱中。每月活期从月接种管中从新接种 3 个转接 管生涯新菌株。 6.1.3 从月接种的造就管中的一支再接种一支乳酸杆菌琼脂造就基 (4.7.1) 试管, 36 ±1℃ ℃造就 24 h, 作为日接种管每日测定用。 6.1.4 从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤造就基(4.7.2),36 ℃ ± 1 ℃造就 24 h。在无菌前提下离 心该造就液 10 min (2000 转/分钟) , 弃去上清液。 用 10 mL 心理盐水 (4.1) 振荡洗迓洫菌体, 离心 10 min (2000 转/分钟),弃去上清液,用 10 mL 心理盐水(4.1)振荡洗迓洫。如前离心支配,弃去上清液。再 加 10 mL 心理盐水(4.1),混匀。吸 1 mL 该菌悬液于 10 mL 心理盐水(4.1)中,混匀制成测试菌液。 GB 5413.172010 3 6.1.5 以心理盐水(4.1)做比照,在分光光度计 550 nm 波长下,测测试菌液(6.1.4)的光密度值, 此值应在 60 ~80 之间。 6.2 试样的处置处分 称取 2 g(准确至 0.0001 g)固态试样或 5 g(准确至 0.0001 g)液态试样(约含泛酸 0.1 mg)于 250 mL 三角烧杯中。介入 10 mL Tris 缓冲液(4.8) ,再介入年夜量水,121 ℃水解 15 min,冷却。用盐酸(4.9) 调pH至4.5 ± 0.2, 转入250 mL容量瓶顶用水定容。 过滤, 吸4 mL滤液, 稀释至泛酸的浓度约为5 ng/mL。 6.3 规范曲线的制作 按表 1 次序递次介入蒸馏水、 规范溶液跟造就基于试管中, 表 1 中每一编号需制作 3 管。 试管 S2 至 S10 中,相当泛酸含量为 0 ng、5 ng、10 ng、15 ng 、20 ng 、25 ng、30 ng、40 ng、50 ng。 表 1 规范曲线管束造 试管号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 蒸馏水(mL) 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 规范溶液(mL) 0 0 1 2 3 4 5 3 4 5 造就基(mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 注 1试管 S3~S7 中加低浓度的为规范溶液。 注 2试管 S8~S10 中加高浓度的为规范溶液。 6.4 试样管的制作 按表 2 次序递次介入蒸馏水、试样跟造就基于试管中,一式三份。 表 2 试样管的制作 试管号 1 2 3 4 蒸馏水(mL) 4 3 2 1 试 样(mL) 1 2 3 4 造就基(mL) 5 5 5 5 6.5 灭菌 将规范曲线管跟试样管 121 ℃灭菌 5 min,矫捷冷却到室温(商品化造就基按标签说明举行灭菌。 注包管加热跟冷却过程中前提平均,灭菌管数过多或距离太近,在灭菌锅中都可孕育产生不良影响。 6.6 接种 在无菌前提下每管中均介入一滴(约 50 μL)测试菌液(6.1.4),加盖,充分振荡混匀全部试管(标 准曲线未接种空白管 S1 除外)。 6.7 造就 36 ℃ ± 0.5 ℃造就 16 h~24 h。对每个试管举行奶镡搜索,未接种管中造就液应是廓清的,规范曲 线管跟试样管中造就液的浊度应有梯度。未接种管中若出现混浊,则测定有用。 6.8 测定 GB 5413.172010 4 以接种空白管(表 1 中试管号 S2)做比照,掏出最高浓度规范曲线管 S7,振荡 5 s,在波长 550 nm 前提下读取光密度值,放回从新造就。2 h 后整齐前提从新测该管的光密度,假如两次光密度的相对差 结果≤2 ,则掏出全部检验管测定例范溶液跟试样的光密度。 6.9 规范曲线的绘制 以规范曲线管泛酸含量作横坐标,以光密度值为纵坐标绘制规范曲线。 6.10 试样管中泛酸含量的算计 依据 6.8 每个试样管测定的光密度值,从规范曲线中查得对应的泛酸含量。每一编号的三个试样管 应算计管中每毫升测定液泛酸的含量,并与三者平均值相比照。相对缺陷小于 15 的试管为有用试管, 有用试样管应舍去。有用试样管总数应年夜于全部试样管总数的 2/3。从新算计每一编号的有用试样管中 每毫升测定液泛酸含量的平均值,以此平均值算计全部编号试样管的总平均值 Cx。 注样品管中泛酸含量低于 5 ng,高于 50 ng 的值应舍去。 7 剖析结果的表述 试样中泛酸含量按式(1)算计 X 100 1000 f m Cx (1) 式中 X试样中泛酸含量,单元为微克每百克(μg/100 g) ; Cx6.10 中算计所得的总平均值,单元为微克(μg) ; f稀释倍数; m试样的质量,单元为克(g) 。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管三位有用数字。 8 精致度 在重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的相对差值不得逾越跨过算术平均值的10 。 第二法 高效液相色谱法 9 道理 试样经热水提取等前处置处分后,经 C18 色谱柱疏散,紫外检测器检测,外标法定量泛酸的含量。 10 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为GB/T 6682规则的一级水。 10.1 淀粉酶酶生气盼望≥1.5 U/mg。 10.2 甲醇CH4O色谱纯。 10.3 盐酸。 10.4 硫酸锌ZnSO4。 GB 5413.172010 5 10.5 盐酸(0.1 mol/L)移取 8.3 mL 盐酸(10.3)于 1000 mL 容量瓶中,用水定容。 10.6 硫酸锌溶液(15 g/100mL)称取 15 g 硫酸锌(10.4)用水消融并定容至 100 mL。 10.7 磷酸二氢钾溶液(0.05 mol/L)称取 6.8 g 磷酸二氢钾,用水消融并定容至 1000 mL。用磷酸调 节 pH 至 3.0,用 0.45 ?m 滤膜过滤。 10.8 泛酸规范溶液 10.8.1 泛酸规范蕴藏液(1 mg/mL)准确称取泛酸钙 1.087 g,加水消融并定容至 1000 mL。 泛酸浓度泛酸钙浓度0.920 10.8.2 泛酸规范中央液(0.1 mg/mL)吸取规范蕴藏液(10.8.1)10 mL 于 100 mL 容量瓶中,加水 定容。临用前配制。 11 仪器跟设备 11.1 天平感量为 0.1 mg。 11.2 高效液相色谱仪,带紫外检测器。 11.3 超声波。 11.4 pH 计精度为 0.01。 11.5 造就箱55 ℃ ± 2 ℃。 12 剖析措施 12.1 试样处置处分 12.1.1 不含淀粉类试样处置处分 称取混杂平均的固态试样约5 g(准确至0.0001 g)或液态试样约20 g(准确至0.0001 g)于150 mL 三角瓶中,固体试样介入约30 mL 40 ℃~50 ℃温水,振摇消融后超声萃取20 min。 12.1.2 含淀粉类试样处置处分 假如试样中含有淀粉,称取混杂平均的固态试样约5 g(准确到0.0001 g)或液态试样约20 g(准确 到0.0001 g)于150mL三角瓶中,介入淀粉酶(10.1)约0.2 g, 固体试样介入约30 mL 40 ℃~50 ℃温水 振摇消融,盖上瓶塞,在50 ℃~60 ℃前提下酶解30 min。 12.2 测定液的制备 试样溶液降至室温后,用盐酸(10.5)调理 pH 至 4.5 ± 0.1,介入 5 mL 硫酸锌溶液(10.6),充分 混杂。 转入 50 mL 容量瓶中, 用水定容至刻度并充分混匀后, 用滤纸过滤。 滤液经 0.45 μm 滤膜过滤后, 即为试样待测液。 12.3 参考色谱前提 色谱柱ODS-C18(粒径 5 ?m, 250 mm4.6 mm )或存在整齐功用的色谱柱。 运动相取磷酸二氢钾溶液(10.7)900 mL,取甲醇(10.2)100 mL,混匀后经0.45 μm微孔滤膜 加压过滤。 流速1.0 mL/min。 检测波长200 nm。 GB 5413.172010 6 柱温30 ℃ ± 1 ℃。 进样量10 μL。 12.4 测定 12.4.1 规范曲线测定 区分准确吸取泛酸规范中央液(10.8.2)1.0 mL,2.0 mL,4.0 mL,8.0 mL,12.0 mL于100 mL容量 瓶中,加水定容至刻度,掉掉浓度区分为1.0 μg/mL,2.0 μg/mL,4.0 μg/mL,8.0 μg/mL,12.0 μg/mL的 泛酸规范变乱液,临用前配制。 将上述泛酸规范变乱依次举行色谱测定(其规范样品色谱图见附录A中图A.1),记载色谱峰高(或 峰面积)。以峰高(或峰面积)为纵坐标,以规范变乱液浓度为横坐标绘制规范曲线。 12.4.2 试样溶液的测定 吸取试样待测液(12.2)10 μL,将试样待测液举行色谱测定,从规范曲线中查得试液中泛酸的浓 度。 13 剖析结果的表述 试样中泛酸的含量按式(2)算计 100 m KCV X2 式中 X试样中泛酸含量,单元为微克每百克(μg/100 g) C试样溶液中泛酸的质量浓度,单元为微克毫升(μg/mL); m 称取试样的质量,单元为克(g); V被测样液总体积,单元为毫升(mL); K样液稀释倍数。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管三位有用数字。 14 精致度 在重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的相对差值不得逾越跨过算术平均值的10 。 15 其他 本规范第二法检出限为 100 μg/100 g。 GB 5413.172010 7 附录 A (资料性附录) 泛酸规范溶液的液相色谱图 A.1 泛酸规范溶液的液相色谱图 泛酸规范溶液的液相色谱图见图 A.1。 图 A.1 泛酸规范溶液的液相色谱图
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