GB5413.15-2010发布稿婴幼儿食物跟乳品中烟酸跟烟酰胺的测定发布稿.rarGB5413.15-2010发布稿婴幼儿食物跟乳品中烟酸跟烟酰胺的测定发布稿.rar

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中华人平易近共跟国国家规范中华人平易近共跟国国家规范 GB 5413.152010 中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部中 华 人 平易近 共 跟 国 卫 生 部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实行 食物僻静国家规范 婴幼儿食物跟乳品中烟酸跟烟酰胺的测定 National food safety standard Determination of vitamin niacin and niacinamide in foods for infants and young children,milk and milk products GB 5413.152010 I 前 言 本规范第二法分歧采用国际剖析财学会(AOAC)944.13 Niacin and NiacinamideNicotinic Acid and Nicotinamide in Vitamin Preparations。 本规范交流GB/T 5413.15-1997婴幼儿配方食物跟乳粉 烟酸跟烟酰胺的测定 。 本规范第二法与GB 5413.15-1997比拟,重要变革如下 增加了光密度法测定; 增加了淀粉类试样的测定; 增加规范曲线绘制的笔墨描写。 本标准附录 A 为资料性附录。 本规范交流规范的历次版本发布状况为 GB 5413-1985、GB/T 5413.15-1997。 GB 5413.152010 1 食物僻静国家规范 婴幼儿食物跟乳品中烟酸跟烟酰胺的测定 1 规模 本规范规则了婴幼儿食物跟乳品中烟酸跟烟酰胺的测定方法。 本规范适用于婴幼儿食物跟乳品中烟酸跟烟酰胺的测定。 2 模范性援用性文件 本规范中援用的文件关于本规范的应用是必不可少的。 素日注日期的援用文件, 仅所注日期的版本 适用于本规范。素日不注日期的援用文件,其最新版本(包含全部的修正单)适用于本规范。 第一法 高效液相色谱法 3 道理 试样经热水提取、酸性积淀卵白质后,以 C18 色谱柱疏散,用紫外检测器定量。 4 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为GB/T 6682规则的一级水。 4.1 淀粉酶酶生气盼望≥1.5 U/mg。 4.2 盐酸。 4.3 氢氧化钠。 4.4 盐酸2.4 mol/L准确移取 10 mL 盐酸(4.2)于 50 mL 容量瓶中,用水定容。 4.5 氢氧化钠溶液(2.5 mol/L)称取 5.0g 氢氧化钠(4.3)于 50 mL 容量瓶中,用水定容。 4.6 高氯酸(HClO4)体积分数为 60。 4.7 甲醇(CH4O)色谱纯。 4.8 异丙醇C3H8O色谱纯。 4.9 庚烷磺酸钠C7H15NaO3S优级纯。 4.10 规范溶液 4.10.1 烟酸及烟酰胺规范蕴藏液 (1.0 mg/mL) 称取烟酸及烟酰胺规范品各 0.1 g (准确到 0.0001 g) , 区分置于 100 mL 容量瓶中,用水消融定容。 4.10.2 烟酸及烟酰胺混杂规范中央液(40 ?g/mL)区分准确吸取烟酸及烟酰胺规范蕴藏液(4.10.1) 2 mL 至 50 mL 定量瓶中,用水定容。临用前配制。 GB 5413.152010 2 4.10.3 烟酸及烟酰胺混杂规范系列测定液区分准确吸取烟酸及烟酰胺混杂规范中央液(4.10.2)0.0 mL、 1.0 mL、 2.0 mL、 5.0 mL、 10.0 mL, 至 50 mL 容量瓶顶用水定容。 该规范系列浓度区分为 0.00 ?g/mL、 0.80 ?g/mL、1.60 ?g/mL、4.00 ?g/mL、8.00 ?g/mL。临用前配制。 5 仪器跟设备 5.1 高效液相色谱仪,带紫外检测器。 5.2 pH 计精度为 0.01。 5.3 超声波振荡器。 5.4 天平感量为 0.1 mg。 5.5 造就箱30 ℃~80 ℃。 6 剖析措施 6.1 试样的预处置处分 6.1.1 含淀粉的试样称取混杂平均固体试样约 5.0 g(准确到 0.0001 g)介入约 25 mL 45 ℃~50 ℃ 的水,或称取混杂平均液体试样约 20.0 g(准确到 0.0001 g)于 150 mL 锥形瓶中,再介入约 0.5 g 淀粉 酶(4.1),摇匀后向锥形瓶中充氮,盖上瓶塞,置于 50 ℃~60 ℃的造就箱内造就约 30 min,掏出冷 却至室温。 6.1.2 不含淀粉的试样称取混杂平均固体试样约 5.0 g(准确到 0.0001 g)介入约 25 mL 45 ℃~50 ℃ 的水,或称取混杂平均液体试样约 20.0 g(准确到 0.0001 g)于 150 mL 锥形瓶中,振摇,静置 5 min~ 10 min,充分消融,并冷却至室温。 6.1.3 提取将上述锥形瓶置于超声波振荡器中振荡约 10 min。 6.1.4 积淀及定容待试样溶液降至室温后,用盐酸(4.4)调理试样溶液的 pH 值至 1.7 ±0.1,安排约 2 min 后,再用氢氧化钠溶液(4.5)调理试样溶液的 pH 值至 4.5 ±0.1。将试样溶液转至 50 mL 容量瓶 中,用水重复冲洗锥形瓶,洗液兼并于 50 mL 容量瓶中,用水定容至刻度,混匀后经滤纸过滤,滤液 再经 0.45 μm 微孔滤膜加压过滤,用试管搜集,即为试样待测液。 6.2 参考色谱前提 色谱柱C18 柱(粒径5 μm,150 mm 4.6 mm)或存在整齐功用的色谱柱。 运动相甲醇(4.7)70 mL,异丙醇(4.8)20 mL,庚烷磺酸钠(4.9)1 g,用910 mL水消融并混 匀后,用高氯酸(4.6)调pH至2.1 ± 0.1,经0.45 μm膜过滤。 流速1.0 mL/min。 检测波长261 nm。 柱温25 ℃。 进样量10 μL。 6.3 定量剖析 6.3.1 规范曲线绘制 将烟酸及烟酰胺混杂规范系列测定液(4.10.3)依次举行色谱测定(其规范样品色谱图拜见附录 A 中图 A.1.1)。记载各组分的色谱峰面积或峰高,以峰面积或峰高为纵坐标,以规范测定液的浓度为横 坐标,绘制规范曲线。 GB 5413.152010 3 6.3.2 试样测定 将试样待测液(6.1.4)举行色谱测定。记载各组分色谱峰面积或峰高,依据规范曲线算计出试样待 测液中烟酸及烟酰胺各组分的浓度 ci。 7 剖析结果的表述 7.1 试样中烟酸或烟酰胺含量的算计 试样中烟酸或烟酰胺的含量按(1)式算计 m Vc X i 100 21 或 (1) 式中 X1或2试样中烟酸或烟酰胺的含量,单元为微克每百克(μg/100 g) ; m试样的质量,单元为克(g) ; ci试样待测液中烟酸或烟酰胺的浓度,单元为微克每毫升(μg/mL); V试样溶液的体积,单元为毫升(mL) 。 7.2 试样中维生素PP总含量的算计 试样中维生素PP的总含量按(2)式算计 X = 12 XX (2) 式中 X试样中维生素 PP 的总含量,单元为微克每百克(μg/100 g) ; X1试样中烟酸的含量,单元为微克每百克(μg/100 g); X2试样中烟酰胺的含量,单元为微克每百克(μg/100 g)。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管两位有用数字。 8 精致度 在重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的相对差值不得逾越跨过算术平均值的10 。 第二法 微生物法 9 道理 应用动物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC 8014 对烟酸跟烟酰胺的特异性,在含有烟酸跟烟 酰胺的样品中开展孕育产生的酸度跟组成的光密度来测定烟酸跟烟酰胺的含量。 10 试剂跟原料 除非尚有规则,本方法所用试剂均为剖析纯,水为 GB/T 6682 规则的二级水。 10.1 硫酸溶液 A(10 mol/L)将质量分数为 95 ~98 的浓硫酸 560 mL 愚钝介入到 600 mL 水中, 边加边搅拌,冷却后定容至 1000 mL。 GB 5413.152010 4 10.2 硫酸溶液 B(1 mol/L)吸取 100 mL 10 mol/L 的硫酸溶液 A(10.1),转移至 1000 mL 容量瓶 用水定容。 10.3 氢氧化钠溶液 A(3.75 mol/L)称取 150 g 氢氧化钠于 1000 mL 烧杯中,用 400 mL 水消融,冷 却至室温后,转移至 1000 mL 容量瓶中,用水定容。 10.4 氢氧化钠溶液 B(0.375 mol/L)吸取 100 mL 氢氧化钠溶液 A(10.3)转移至 1000 mL 容量瓶 用水定容。 10.5 氢氧化钠规范滴定溶液(0.1 mol/L ± 0.0002 mol/L)称取 4g(准确至 0.0001 g)氢氧化钠用水 稀释至 1000 mL,用邻苯二甲酸氢钾标定。生涯此溶液的容器要密封,以防二氧化碳浸透排泄。 10.5.1 氢氧化钠规范溶液的标定称取约 0.18 g(准确至 0.0001 g)于 105 ℃~110 ℃烘至恒重的邻 苯二甲酸氢钾,用 50 mL 除二氧化碳的水溶于锥形瓶中,加两滴 5 g/L 的酚酞唆使剂,用配好的氢氧化 钠溶液滴定至粉赤色,同时作空白实行。氢氧化钠规范溶液的浓度为 c 2042. 0 m 21 ?VV 3 式中 c氢氧化钠的浓度,单元为摩尔每升(mol/L) ; m邻苯二甲酸氢钾的质量,单元为克(g) ; V1氢氧化钠溶液的用量,单元为毫升(mL) ; V2空白试验氢氧化钠溶液的用量,单元为毫升(mL) 。 10.5.2 酚酞溶液称取 0.5 g 酚酞溶于 75 mL 体积分数为 95 的乙醇中,并介入 20mL 水,介入氢氧 化钠规范滴定溶液(10.5),直至介入一滴立刻酿成粉赤色,再介入水定容至 100 mL。 10.6 盐酸(0.1 mol/L)吸取 8.3 mL 盐酸,用水稀释至 1000 mL。 10.7 乙醇溶液体积分数为 25 。量取 250 mL 无水乙醇,介入 750 mL 水,混匀。 10.8 菌株动物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC 8014。 10.9 造就基(或可应用商品化的分化造就基) 10.9.1 乳酸杆菌琼脂造就基光解胨 15 g,葡萄糖 10 g,番茄汁 100 mL,磷酸二氢钾 2 g,聚山梨糖 单油酸酯 1 g,琼脂 10 g,加蒸馏水至 1000 mL,pH6.8 ± 0.2(20 ℃~25 ℃)。 121℃高压灭菌 15min, 备用。 10.9.2 乳酸杆菌肉汤造就基光解胨 15g,葡萄糖 10 g,番茄汁 100 mL,磷酸二氢钾 2 g,聚山梨糖 单油酸酯 1 g,加蒸馏水至 1000 mL,pH 6.8 ± 0.2(20 ℃~25 ℃)。121℃高压灭菌 15min,备用。 10.9.3 烟酸测定用造就基维生素测定用 Casamino Acids 12 g,葡萄糖 40 g,乙酸钠 20 g,L-胱氨酸 0.4 g,DL-色氨酸 0.2 g,盐酸腺嘌呤 20 mg,盐酸鸟嘌呤 20 mg,尿嘧啶 20 mg,盐酸硫胺素 200 μg, 泛酸钙 200 μg,盐酸吡哆醇 400 μg,核黄素 400 μg,p-氨基苯甲酸 100 μg,生物素 0.8 μg,磷酸氢二钾 1 g,磷酸二氢钾 1 g,硫酸镁 0.4 g,氯化钠 20 mg,硫酸亚铁 20 mg,硫酸锰 20 mg。加蒸馏水至 1000 mL,调 pH 至 6.7 ± 0.2(20 ℃~25 ℃)。 10.10 规范溶液 GB 5413.152010 5 10.10.1 烟酸规范蕴藏液 (100 μg/mL) 在五氧化二磷逝世板器中掏出已逝世板的烟酸规范品, 称取 50.0 mg 准确至 0.1 mg,用乙醇溶液(10.7)消融并定容至 500 mL,2 ℃~4 ℃冰箱冷藏,生涯期为 4 个 月。 10.10.2 烟酸规范中央溶液(10 μg/mL)从烟酸规范蕴藏液(10.10.1)中吸取 10 mL 至 100 mL 容 量瓶,用乙醇溶液(10.7)定容,2 ℃~4 ℃冰箱冷藏,生涯期为 1 个月。 10.10.3 烟酸规范变乱液 (100 ng/mL) 从规范中央液 (10.10.2) 中吸取 5.0 mL, 用水稀释至 500 mL。 临用前配制。 10.11 0.9 心理盐水称 0.9 g 氯化钠于 100 mL 容量瓶中,稀释至刻度,振荡消融。分装于具塞试管 中,每管 10 mL,121 ℃灭菌 15 min,每周准备一次。 10.12 溴麝喷鼻草酚蓝唆使剂称取 0.1 g 溴麝喷鼻草酚蓝于研钵中,介入 1.6 mL 氢氧化钠规范滴定溶液 (10.5)研磨,加少许水至完好消融,转移至 250 mL 容量瓶顶用水定容。 11 仪器跟设备 11.1 分光光度仪。 11.2 pH 计精度为 0.01。 11.3 涡旋振荡器。 11.4 天平感量为 0.1 mg。 11.5 生化造就箱36 ℃ ±1 ℃。 11.6 离心计心情转速≥2000 转/分钟。 11.7 滴定管分刻度值为 0.1 mL。 12 剖析措施 12.1 测试菌液的制备 12.1.1 把动物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) ATCC 8014 冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤造就基 (10.9.2) 试管中,36 ℃ ± 1℃造就 24 h,转接至乳酸杆菌琼脂造就基(10.9.1)试管中,36 ℃ ± 1 ℃再造就 24 h。 造就好的乳酸杆菌琼脂造就基(10.9.1)试管的造就物作为蕴藏菌种。 12.1.2 从蕴藏菌种造就基上区分转接到三个乳酸杆菌琼脂造就基(10.9.1)试管中,放入造就箱中 36 ℃ ± 1 ℃造就 24 h。每月转接一次,作为月接种管贮于冰箱中。每月活期从月接种管中从新接种 3 个转 担负生涯新菌株。 12.1.3 从月接种的造就管中的一支再接种一支乳酸杆菌琼脂造就基(10.9.1)试管,36 ℃ ±1 ℃造就 24 h,作为日接种管每日测定用。 12.1.4 从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤造就基(10.9.2),36 ℃ ± 1 ℃造就 24 h。在无菌前提下 离心该造就液 10 min(2000 转/分钟),弃去上清液。用 10 mL 心理盐水(10.11)振荡洗迓洫菌体,离心 10 min(2000 转/分钟),弃去上清液,再介入 10 mL 心理盐水(10.11)振荡洗迓洫。如前离心支配,弃 去上清液。再加 10 mL 心理盐水(10.11),混匀。吸取适量该菌悬液于 10 mL 心理盐水(10.11)中, 混匀制成测试菌液。 12.1.5 以心理盐水(10.11)做比照,用分光光度计于 550 nm 波长下,测测试菌液(12.1.4)的透光 率,此值应在 60 ~80 之间。 GB 5413.152010 6 12.2 试样的制备 称取 2 g(准确至 0.0001 g)固态试样或 5 g(准确至 0.0001 g)液态试样(约含烟酸 0.1 mg)于 250 mL 三角烧瓶中,加 20 mL 的硫酸溶液 B(10.2)消融试样,放入高压灭菌釜中 121 ℃坚持 30 min,取 出冷却至室温。 用氢氧化钠溶液 A (10.3) 跟氢氧化钠溶液 B (10.4) 调 pH 至 6.0~6.5, 再用盐酸 (10.6) , 调 pH 至 4.5 ± 0.1,用水定容至 100 mL,过滤。吸取 25 mL 滤液于 100 mL 烧杯中,用氢氧化钠规范滴 定溶液(10.5)调 pH 至 6.8 ± 0.1,转入 250 mL 容量瓶中定容。 12.3 规范曲线管的制作 按表 1 次序递次介入蒸馏水、规范溶液跟造就基于试管中,表 1 中每一编号需制作 3 管。试管 S2 至 S7 中,相当烟酸含量为 0 ng、100 ng、200 ng、300 ng、400 ng、500 ng。 表 1 规范曲线管的制作 试管号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 蒸馏水(mL) 5 5 4 3 2 1 0 规范溶液(mL) 0 0 1 2 3 4 5 造就基(mL) 5 5 5 5 5 5 5 12.4 试样管的制作 按表 2 次序递次介入蒸馏水、试样跟造就基于试管中,表中每一编号需制作 3 管。 表 2 试样管的制作 试管号 1 2 3 4 蒸馏水(mL) 4 3 2 1 样 品(mL) 1 2 3 4 造就基(mL) 5 5 5 5 12.5 灭菌 将规范曲线管跟试样管 121 ℃灭菌 5 min,矫捷冷却到室温(商品化造就基按标签说明举行灭菌。 注包管加热跟冷却过程中前提平均,灭菌管数过多或距离太近,在灭菌锅中都可孕育产生不良影响。 12.6 接种 在无菌前提下,向上述每管中各介入一滴(约 50 μL)测试菌液(12.1.4) ,加盖,充分振荡混匀所 有试管(规范曲线未接种空白管 S1 除外) 。 12.7 造就 12.7.1 酸度法在 36 ℃ ± 1 ℃,造就 72 h。经过对每个试管的目测搜索,未接种试管内造就液应是 廓清的,规范曲线管跟试样管中造就液的浊度应有梯度。未接种管若混浊,则测定有用。 12.7.2 光密度法在 36 ℃ ± 1 ℃,造就 16 h~24 h。其他同 12.7.1。 12.8 测定 12.8.1 酸度法 12.8.1.1 用 10 mL 水将未接种空白管 S1 跟接种空白管 S2 的造就物转至三角烧瓶中,以溴麝喷鼻草酚 蓝(10.12)作唆使剂,或用 pH 计以 pH 6.8 ± 0.2 为滴定止境用氢氧化钠规范滴定溶液(10.5)滴定标 准曲线未接种空白管 S 1 跟接种空白管 S 2。记载下消耗的氢氧化钠规范滴定溶液体积。 GB 5413.152010 7 注假如接种空白滴定回声消耗的氢氧化钠规范滴定溶液体积数就是或高于未接种空白水平的1.5 mL,则测定结果 有用。 12.8.1.2 用 10 mL 水将规范曲线管跟试样管中的造就物转至三角烧瓶中,以溴麝喷鼻草酚蓝(10.12) 作唆使剂,或用 pH 计以 pH 6.8 ± 0.2 为滴定止境用氢氧化钠规范滴定溶液(10.5)滴定例范曲线管跟试 样管的造就物。记载下消耗的氢氧化钠规范滴定溶液体积。 注通惯例范曲线管 S7 消耗的氢氧化钠规范滴定溶液体积数在 8 mL~12 mL 之间。 12.8.2 光密度法 以接种空白管 (表 1 中试管号 S 2) 作比照, 掏出最高浓度规范曲线管 S 7, 振荡 5 s, 在波长 550 nm 前提下读取光密度值,放回从新造就。2 h 后整齐前提从新测该管的光密度,假如两次光密度的相对差 结果≤2 ,则掏出全部检验管测定例范溶液跟试样的光密度。 12.9 规范曲线的绘制 以规范曲线管烟酸含量作横坐标, 以消耗氢氧化钠规范滴定溶液的滴定毫升数或光密度值为纵坐标 绘制规范曲线。 12.10 试样管中烟酸含量的算计 依据 12.8 每个试样管测定消耗的氢氧化钠规范滴定溶液的毫升数或光密度值,从规范曲线中查得 对应的烟酸含量。每一编号的三个试样管应算计管中每毫升测定液烟酸的含量,并与其平均值相比照。 相对缺陷小于 15 的试管为有用试管,有用试样管应舍去,有用试样管总数应年夜于全部试样管总数的 2/3。从新算计每一编号的有用试样管中每毫升测定液烟酸含量的平均值,以此平均值算计全部编号试 样管的总平均值Cx。 注样品管中烟酸含量低于 100 ng,高于 500 ng 的值应舍去。 13 剖析结果的表述 试样中烟酸(烟酰胺)含量按式(4)算计 X100 1000 f m Cx (4) 式中 X试样中烟酸(烟酰胺)含量,单元为微克每百克(μg/100 g) ; Cx 13.10 中算计所得的总平均值,单元为纳克(ng) ; f稀释倍数; m试样的质量或体积,单元为克(g) 。 以重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的算术平均值表现,结果保管两位有用数字。 14 精致度 在重复性前提下掉掉的两次自力测定结果的相对差值不得逾越跨过算术平均值的 10 。 15 其他 本规范第一法检出限为烟酸30 μg/100 g,烟酰胺40 μg/100 g。 GB 5413.152010 8 附录 A (资料性附录) 烟酸跟烟酰胺规范溶液的液相色谱图 A.1 烟酸跟烟酰胺规范溶液的液相色谱图 烟酸跟烟酰胺规范溶液的液相色谱图见图 A.1。 图 A.1 烟酸跟烟酰胺规范溶液的液相色谱图
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